Perfis de virulência, imunogenicidade e diagnóstico dos principais patógenos do gênero Sporothrix

Abstract

Sporotrichosis is a chronic cutaneous and subcutaneous mycosis that affects humans and animals, classified as an implantation disease due to the traumatic inoculum of material contaminated with Sporothrix propagules or scratches and bites from contaminated cats. Sporothrix brasiliensis, S. schenckii, and S. globosa are the main human and animal pathogens and are considered more virulent than environmental species. Brazil and China harbor current outbreaks of S. brasiliensis and S. globosa, and it is relevant to increase our knowledge about virulence and the identification of Sporothrix species. This thesis is divided into three chapters, the first addressing virulence in S. globosa, the second a diagnosis by quantitative realtime PCR (qPCR) from Sporothrix, and the third to experimental pulmonary sporotrichosis. Our first objective was to evaluate the virulence and immunogenicity profiles of S. globosa distributed throughout South America, Europe, and Asia, compared with isolates of S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa, and S. chilensis, using a disseminated murine model and subcutaneous. To characterize virulence, BALB/c mice were divided into groups and were infected with 5x106 yeast/animal cells intravenously (7 days of infection) or subcutaneously (20 days of infection). After the challenge, isolates of S. globosa were classified as non-virulent, with low or medium virulence, based on the induction of death in infected animals, the fungal load of evaluated organs, and weight loss. CFU showed different results in each infection pathway. In the subcutaneous group, isolates Ss126, Ss226 and Ss545 developed lesions characteristic of sporotrichosis in the animals' footpad. Among histopathological features are granuloma, inflammatory infiltrate, suppurative inflammation, necrosis, hypertrophic tubules (in the kidneys), and thick pulmonary alveoli. Arthritis lesions affected almost 100% of the animals and caused irreversible sequelae in the intravenous group. In the tail, some animals showed a wound, nodule, or sinuosity. Sera from animals infected with Sporothrix spp. by the intravenous route recognized in greater number the molecules of 22, 26, and 28 kDa of the total extract of Ss226 (S. brasiliensis); 50 kDa of the extract of Ss126 (S. schenckii) and 100 kDa of the extract of Ss06 (S. globosa). The sera of animals that had an infection by the subcutaneous route recognized in prevalence the molecules of 38, 40, and 48 kDa of the total extract of Ss226 (S. brasiliensis); 30, 38, and 40 kDa of the total extract of Ss126 (S. schenckii); 38 and 40 kDa of the total extract of Ss06 (S. globosa). The subcutaneous route showed a higher level of antibodies in the animals' serum than the intravenous route due to the longer time of infection, which occurred with Western blotting. Chapter 2: The real-time PCR technique, based on fluorescent probes, is faster to identify the main species of pathogens from Sporothrix spp. The variation between the BT2 gene was explored to design a qPCR assay with triplex probes to identify the species S. brasiliensis, S. schenckii, and S.iv globosa in a multiplex qPCR assay. A panel of 84 Sporothrix revealed 100% specificity (AUC = 1,000, 95% CI = 0.971–1,000, P <0.0001) without cross-reacting with other clinically relevant fungi, human, feline, or murine DNA. We used swab samples from 70 naturally infected cats, and in our test, 69 samples were positive for S. brasiliensis (sensitivity = 98.57%; 95% CI: 92.3–100.0 and specificity = 100%; 95% CI = 78.2-100), confirming that our trial helps to detect and differentiate pathogenic Sporothrix, providing clinical laboratories with an essential tool to be applied routinely. Our trial is likely to benefit thousands of infected patients every year worldwide. Chapter 3: Pulmonary sporotrichosis occurs by inoculation through inhalation of Sporothrix conidia. It is a rare type of infection, usually affecting people who work in the field, with gardening, and usually occurs in hypertensive patients or patients with some involvement in the lungs, despite reports of immunocompetence. We performed a model of pulmonary sporotrichosis so that we could understand a little more about this disease, which has led some patients to death despite occurring at low frequency. We used the isolates of S. brasiliensis, S. schenckii, and S. globosa, classified as high, medium, and low virulence, in an experimental murine model using the intratracheal route of BALB/c mice with inoculum in groups of animals that received either conidia or yeast. The isolate of S. brasiliensis obtained greater virulence than the other isolates, as it has a high CFU and induces animals to death by the second week after infection, both by the yeast inoculum and the conidia inoculum. The isolates of S. schenckii and S. globosa were classified with low virulence by this route of infection for the CFU study and avirulent for not inducing animals to death in the survival study.

A esporotricose é micose cutânea e subcutânea crônica que afeta o homem e animais, classificada como doença de implantação pelo inóculo traumático de material contaminado com propágulos de Sporothrix ou arranhões e mordidas de felinos contaminados. Sporothrix brasiliensis, S. schenckii e S. globosa são os principais patógenos humanos e animais e são considerados com maior virulência em comparação com espécies ambientais. Brasil e China abrigam surtos atuais de S. brasiliensis e S. globosa, sendo relevante aumentar nossos conhecimentos sobre a virulência e a identificação das espécies de Sporothrix. Esta tese se divide em 3 capítulos, o primeiro aborda a virulência em S. globosa, o segundo em diagnóstico por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) de Sporothrix e o terceiro a esporotricose pulmonar experimental. Nosso primeiro objetivo foi avaliar os perfis de virulência e imunogenicidade de S. globosa distribuídos pela América do Sul, Europa e Ásia, comparado com isolados de S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa e S. chilensis, utilizando modelo murino disseminado e subcutâneo. Para a caracterização da virulência, camundongos BALB/c foram divididos em grupos e foram infectados com 5x106 células de levedura/animal por via intravenosa (7 dias de infecção) ou subcutânea (20 dias de infecção). Após o desafio, os isolados de S. globosa foram classificados como não virulentos, com baixa ou média virulência, com base na indução de morte de animais infectados, carga fúngica dos órgãos avaliados e perda de peso. As UFC mostraram resultados diferentes em cada via de infecção. No grupo subcutâneo, os isolados Ss126, Ss226 e Ss545 desenvolveram lesões características da esporotricose na pata dos animais. Dentre as características histopatológicas encontramos granuloma, infiltrado inflamatório, inflamação supurativa, necrose, túbulos hipertróficos (nos rins) e alvéolos pulmonares espessos. As lesões de artrite na pata dianteira e para traseira acometeram quase 100% dos animais e causaram sequelas irreversíveis no grupo intravenoso. Na cauda alguns animais apresentaram ferida, nódulo ou sinuosidade. Os soros dos animais infectados com os isolados de Sporothrix spp. pela via intravenosa reconheceram em maior número as moléculas de 22, 26 e 28 kDa do extrato total de Ss226 (S. brasiliensis); 50 kDa do extrato de Ss126 (S. schenckii) e 100 kDa do extrato de Ss06 (S. globosa). Os soros dos animais que tiveram infecção pela via subcutânea reconheceram em prevalência as moléculas de 38, 40 e 48 kDa do extrato total de Ss226 (S. brasiliensis); 30, 38 e 40 kDa do extrato total de Ss126 (S. schenckii); 38 e 40 kDa do extrato total de Ss06 (S. globosa). A via subcutânea apresentou um maior nível de anticorpos no soro dos animais do que a via intravenosa, devido ao tempo maior de infecção, o mesmo que ocorreu com o Western blotting. Capítulo 2: A técnica de PCR em tempo real, baseada em sondas fluorescentes é mais rápida para identificação das principais espécies de patógenos de Sporothrix spp. A variação entre o gene BT2 foi explorada para projetar um ensaio qPCR com sondas triplex para identificar as espécies S. brasiliensis, S. schenckii e S. globosa em um ensaio qPCR multiplex. Um painel de 84 Sporothrix revelou 100% deii especificidade (AUC = 1,000, 95% CI = 0,971–1,000, P <0,0001) sem reação cruzada com outros fungos clinicamente relevantes, DNA humano, felino ou murino. Utilizamos amostras de esfregaços de lesões de 70 gatos naturalmente infectados e em nosso teste 69 amostras foram positivas para S. brasiliensis (sensibilidade = 98,57%; IC 95%: 92,3–100,0 e especificidade = 100%; IC95% = 78,2-100), confirmando que nosso ensaio ajuda a detectar e diferenciar Sporothrix patogênico, fornecendo aos laboratórios clínicos uma ferramenta essencial para ser aplicada rotineiramente. Nosso ensaio provavelmente beneficiará milhares de pacientes infectados todos os anos em todo o mundo. Capítulo 3: A esporotricose pulmonar ocorre por inoculação através da inalação de conídios de Sporothrix. É um tipo de infecção rara, geralmente acomete pessoas que trabalham no campo, com jardinagem e geralmente ocorre em hipertensos ou pacientes com algum acometimento nos pulmões, apesar de haver relatos de imunocompetentes. Realizamos um modelo de esporotricose pulmonar para que pudéssemos entender um pouco mais sobre esta doença que apesar de ocorrer em baixa frequência, tem levado alguns pacientes à óbito. Utilizamos os isolados de S. brasiliensis, S. schenckii e S. globosa, classificados com alta, média/baixa e baixa virulência em modelo murino experimental pela via intratraqueal de camundongos BALB/c com inóculos em grupos de animais que receberam ou conídios ou leveduras. O isolado de S. brasiliensis obteve uma maior virulência em comparação aos outros isolados, por possuir uma alta UFC e induzir os animais à morte até a segunda semana após a infecção, tanto pelo inóculo de levedura, quanto o inóculo de conídios. Os isolados de S. schenckii e S. globosa foram classificados com uma baixa virulência por esta via de infecção para o estudo de UFC e avirulentos por não induzirem os animais à morte no estudo de sobrevida.