Efeito do tratamento preventivo com Lacticaseibacillus rhamnosus sobre a inflamação pulmonar, o estresse oxidativo e a função respiratória em modelo murino de exposição à fumaça de cigarro e ao LPS

Abstract

Introdução A fumaça de cigarro é um dos principais fatores de risco para diversas doenças como a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC ). A inalação da fumaça de cigarro em contato com as vias aéreas gera uma inflamação pulmonar aguda, desencadeando um influxo de células inflamatórias e um desequilíbrio oxidativo. Devido ao quadro inflamatório e ao desequilíbrio oxidativo causado pela exposição à fumaça de cigarro, os tratamentos convencionais na DPOC se demonstram pouco específicos e eficazes. Desta maneira, um crescente número de estudos tem demonstrado que a suplementação com probióticos na dieta pode ter um potencial benéfico para reduzir o processo inflamatório e o dano oxidativo desencadeado pela doença. Objetivo Este projeto visou investigar os efeitos benéficos da suplementação dietética dos probióticos Lacticaseibacillus rhamnosus no processo inflamatório pulmonar agudo em camundongos expostos à fumaça de cigarro e a LPS. Métodos A inflamação foi induzida por inalação de duas sessões diárias de fumaça de 7 cigarros por sessão durante 3 dias sendo o último dia administrado LPS via intranasal à 0.3mg/mL em camundongos C57Bl/6. Os animais foram tratados com L. rhamnosus 4 dias antes da indução da inflamação e continuaram até o fim do protocolo. Após 24 horas da aplicação de LPS os animais foram eutanasiados e coletado o lavado bronco alveolar para avaliar o perfil inflamatório (IL-6, TNF, IL-1β, CXCL1, CCL2, IFN-γ e anti-inflamatórios como IL-10 e TGF- β) por ELISA e posteriormente, os pulmões foram removidos e feitos cortes para análise histológica (quantificação de células, deposição de fibras de colágeno, destruição de fibras elásticas e produção de muco) e para expressão do mRNA de mediadores inflamatórios (MMP9 e MMP12, NF-κB, STAT3 e TLR 2,4 e 9) por RT-PCR. Foi analisada também no tecido pulmonar por espectrofotometria a atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT, medida a peroxidação lipídica por ensaio de quimioluminescência e analisado por ELISA a NADPHoxidase. Os parâmetros mecânicos como a resistência pulmonar (Gtis), a elastância pulmonar (Htis) e a resistência das vias aéreas (Raw) foram analisados em um aparelho FlexiVent®. Além dos resultados in vivo, avaliamos a secreção de ERO em cultivo celular de macrófagos humano (U937) expostos ao extrato de fumaça de cigarro e ao LPS. vii Resultados Os resultados mostram que o tratamento com o L. rhamnosus atenuou o influxo de neutrófilos e linfócitos no LBA e no parênquima pulmonar, reduziu a concentração de citocinas pró-inflamatórios, e aumentou os níveis de TGF-β e IL-10. Apesar de não apresentar um efeito antioxidante in vivo, os L. rhamnosus em macrófagos humanos reduziu a secreção de ERO. Conclusões Esses dados demonstram que o probiótico L. rhamnosus induziu efeito protetor na inflamação aguda causada pela fumaça de cigarro e instilação de LPS.

Introduction Cigarette smoke is one of the main risk factors for several diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD). The inhalation of cigarette smoke in contact with the airways generates acute pulmonary inflammation, triggering an influx of inflammatory cells and an oxidative imbalance. Due to the inflammatory condition and oxidative imbalance caused by exposure to cigarette smoke, conventional treatments in COPD are not very specific and effective. Thus, a growing number of studies have shown that supplementation with probiotics in the diet can have a beneficial potential to reduce the inflammatory process and oxidative damage triggered by the disease. This project aimed to investigate the beneficial effects of dietary supplementation of probiotics Lacticaseibacillus rhamnosus on the acute pulmonary inflammatory process in mice exposed to cigarette smoke and LPS. Methods Inflammation was induced by inhalation of two daily sessions of smoke of 7 cigarettes per session for 3 days with the last day administered LPS intranasally at 0.3mg / mL in C57Bl / 6 mice. The animals were treated with L. rhamnosus 4 days before the induction of inflammation and continued until the end of the protocol. 24 hours after the application of LPS, the animals were euthanized and the bronchoalveolar lavage was collected to assess the inflammatory profile (IL-6, TNF, IL-1β, CXCL1, CCL2, IFN-γ and anti-inflammatory molecules such as IL-10 and TGFβ) by ELISA and later, the lungs were removed and cuts were made for histological analysis (cell quantification, collagen fiber deposition, destruction of elastic fibers and mucus production) and for expression of the mRNA of inflammatory mediators (MMP9 and MMP12, NF-κB, STAT3 and TLR 2.4 and 9) by RT-PCR. The activity of the antioxidant enzymes SOD and CAT was also analyzed in the lung tissue by spectrophotometry, the lipid peroxidation was measured by chemiluminescence assay and analyzed by ELISA to NADPHoxidase. Mechanical parameters such as pulmonary resistance (Gtis), pulmonary elastance (Htis) and airway resistance (Raw) were analyzed using a FlexiVent® device. In addition to the in vivo results, we evaluated the secretion of ROS in human macrophages (U937) cells exposed to cigarette smoke extract and LPS. Results The results show that L. rhamnosus attenuated the influx of neutrophils and lymphocytes in BAL and in the lung parenchyma, reduced the concentration of pro-inflammatory cytokines, and increased levels of TGF-β and IL-10. Despite not having an antioxidant effect in vivo, L. rhamnosus in human macrophages reduced ROS secretion. Conclusions These data demonstrate that the probiotic L. rhamnosus induced a protective effect on acute inflammation caused by cigarette smoke and instillation of LPS.