Efeitos da suplementação de fitosterol na expressão do MIR-33A/B

Abstract

Background: Phytosterols (Ps) are bioactive compounds found in plant foods, not synthetized by our body that inhibit diet and endogenous cholesterol (Ch) absorption in the intestine. When regularly consumed, the higher the Ps ingestion, the lower the Ch absorption, thus reducing plasma Ch concentrations. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding endogenous RNAs that regulate post-transcriptional gene expression and can be found in all cells and body fluids in the free form or packed in exosomes. They participate in the regulation of many physiological processes and its disregulation has been associated to diseases. miRNA33-a, miRNA 33-b and its host product SREBP (sterol regulatory elementbinding protein) have been described in the regulation of Ch and HDL metabolism. However, there is a lack of studies linking Ps and miRNAs. Objectives: To evaluate the expression of miR-33a and miR-33b in cell lines Hep G2, Caco-2 and THP-1 in response to treatment with Ps and Ch. Methods: Hep- G2, Caco-2 and THP-1 cells were cultured and treated with beta-sitosterol (Ps), cholesterol (Ch), beta-sitosterol/cholesterol (PsCh) (25 μM for 24 h), or culture medium alone, controls (C). Total RNA extraction, including miRNAs, was done using TRIzol™ Reagent. The expression levels of microRNAs was analysed by RT-qPCR, using the Poly-A tailing protocol for non-coding RNA (ncRNA), with analysis by comparative Ct (2-ΔΔCt). The results were compared between groups by ANOVA or Kruskal-Wallis test, with significance set at a p-value <0,05. Results: Hep-G2 Ch cells showed lower expression levels of miR-33a (p<0,001) when compared with Hep-G2 Ps and, of miR33-b, when compared with Hep-G2 Ps and Hep-G2 PsCh (p<0,001). In THP-1 Ch we observed higher levels of miR- 33a expression when compared with THP-1 Ps (p<0,005) and THP-1 PsCh (p<0,05); the expression levels of miR33-b was higher in THP-1 Ch cells compared with THP-1 Ps (p<0,01). In Caco-2 cells, miR-33b had higher expression levels than miR-33a, and was not influenced by Ch, Ps ou ChPs incubation. Conclusions: The in vitro expression of miR33-a and miR33-b in THP-1 and Hep-G2 cell lines, but not in Caco2, is modulated by sterols (Ch and Ps).

Fundamento: Os fitosteróis (Ps) são compostos bioativos presentes em alimentos vegetais, não sintetizados pelo corpo humano. Inibem a captação dietética e endógena do colesterol no intestino e, quanto maior a ingestão de Ps, menor a absorção de colesterol, reduzindo as concentrações de colesterol plasmático, se consumidos regularmente. MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs endógenos não codificadores que regulam a expressão gênica póstranscricional, e são encontrados em todas as células e nos fluidos corporais na forma livre ou empacotados dentro de exossomos. Participam na regulação de uma série de processos fisiológicos e sua desregulação tem sido associada ao desenvolvimento de doenças. O miR-33a e o miR-33b e seu gene hospedeiro SREBP (proteína de ligação ao elemento de resposta ao esterol) foram descritos na regulação do metabolismo da HDL e do colesterol. No entanto, identificamos uma falta de estudos sobre a interação dos miRNAs e os Ps. Objetivos: Avaliar a expressão do miR-33a e miR-33b em linhas celulares Hep G2, Caco-2 e THP- 1 em resposta ao tratamento com Ps e colesterol. Métodos: Células Hep-G2, Caco-2 e THP-1 foram cultivadas e tratadas com beta-sitosterol (Ps), colesterol (Ch), beta-sitosterol/colesterol (PsCh), a uma concentração de 25 μM durante 24 horas e, meio de cultura apenas, controle (C). A extração do RNA total, incluindo a fração de miRNA, foi realizada por meio da utilização de TRIzol™ Reagent. Os níveis de expressão de microRNAs foram analisados por RT-qPCR, usando um protocolo de Poly-A tailing para RNA não codificante (ncRNA), com análise por Ct comparativa (2-ΔΔCt). Os resultados foram comparados entre os grupos por ANOVA ou teste de Kruskal-Wallis, com nível de significância <0,05. Resultados: Nas células Hep-G2 Ch, houve uma menor expressão de miR-33a (p<0,001) quando comparada às células Hep-G2 Ps e, de miR33-b quando comparada às células Hep-G2 Ps e Hep-G2 PsCh (p<0,001). Nas células THP- 1 Ch, observou-se maiores níveis de expressão de miR-33a quando comparada às células THP-1 Ps (p<0,005) e THP-1 PsCh (p<0,05); a expressão do miR33- b foi maior em células THP-1 Ch comparada às THP-1 Ps (p<0,01). Na linhagem Caco-2, o miR-33b teve maior expressão do que o miR-33a, não sendo seus níveis influenciados pelo Ch, Ps ou ChPs. Conclusões: a expressão dos miRXVIII 33a e miR-33b in vitro em células THP-1 e Hep-G2, mas não em Caco2, é modulada pelos esteróis (Ch e Ps).