Avaliação da sinalização intracelular mediada por agente desacoplador mitocondrial em modelo celular da doença de Alzheimer

Abstract

Studies indicate that aging is the main risk factor associated with the onset of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD). This is a progressive and incurable disease, and as it evolves to the severe dementia, the histopathological markers such as amyloid plaques and neurofibrillary tangles are more frequently observed. The pathophysiological alterations of AD and tauopathies (characterized by dementia and accumulation of tau protein) has not yet been fully elucidated, although it has been associated the neuronal cell death to the imbalance of molecules and essential ions for the maintenance of cellular homeostasis, such as the mitochondrial Ca 2+ accumulation. Thus, the objective of this study was to investigate the intracellular signaling induced by the uncoupler of the mitochondrial electron chain, DNP, in a cellular model of tauopathy, as well as its involvement in the process of cell death or protection. For this, SH-SY5Y control (CTR) cells were used, which conditionally overexpresses (by the Tet-On system) the tau protein WT (isoform 0N4R) and P301L (mutated), fused to eGFP. Our data shows that DNP does not alter cell viability at concentrations up to 100 µM and that it does not promote cell resistance to high metabolic and excitotoxic stress, but that it can promote a positive response against the oxidative stress. Moreover, our results show that treatment with DNP in SH-SY5Y control cells promotes the mobilization of intracellular Ca 2+ even after depletion of the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria stores, however the WT and P301L cells did not show significant changes of Ca 2+ mobilization after treatment of (10 µM and 100 µM) of DNP. Nevertheless, when submitted to treatment with the mitochondrial uncoupler FCCP, these cells presented a reduction in mitochondrial Ca 2+ mobilization. In addition, DNP demonstrated differential modulation of the mitochondrial membrane potential (∆Ψm) in cells that overexpress the tau WT and mutated P301L protein. These results suggest that DNP does not induce toxicity in cells that overexpress the tau protein in high concentrations and, despite not differentially modulating Ca 2+ signaling in the model of tauopathy, these cells already show impaired physiology and are more sensitive to the loss of ∆Ψm.

Estudos indicam que o envelhecimento é o principal fator de risco associado ao aparecimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Esta é uma doença progressiva e incurável e, conforme evolui para o avanço do quadro demencial severo, podem ser observados com maior frequência os marcadores histopatológicos característicos, como as placas amiloides e emaranhados neurofibrilares. As alterações fisiopatológicas da DA e das tauopatias (caracterizadas por demência e acúmulo da proteína tau) ainda não foram completamente elucidadas, porém já foi associada a morte neuronal com o desbalanço de moléculas e íons essenciais para a manutenção da homeostase celular, dentre eles o acúmulo de Ca2+ mitocondrial. Desta forma, o objetivo deste estudo foi investigar a sinalização intracelular induzida pelo desacoplador da cadeia mitocondrial de elétrons, o DNP, em modelo um modelo celular de tauopatia, bem como o seu envolvimento no processo de morte ou proteção celular. Para tanto, foram utilizadas células SH-SY5Y controle (CTR) e que superexpressam condicionalmente (pelo sistema Tet-On) a proteína tau WT (isoforma 0N4R) e P301L (mutada), ligadas a eGFP. Nosso trabalho mostra que o DNP não altera a viabilidade celular em concentrações de até 100 µM e que não promove uma resistência celular a um estresse metabólico e excitotóxico, mas que pode promover uma resposta positiva ao estresse oxidativo. Além disso, nossos resultados mostram que o tratamento com o DNP nas células controle SH-SY5Y promove a mobilização do Ca2+ intracelular mesmo após a depleção dos estoques do retículo endoplasmático (RE) e mitocôndria, porém as células tau WT e P301L não apresentaram alterações significativas na mobilização de Ca2+ após tratamento de (10 µM e 100 µM) de DNP. No entanto, quando submetidas ao tratamento com o desacoplador mitocondrial FCCP, estas células tiveram uma redução na mobilização de Ca2+ mitocondrial. Além disso, o DNP demonstrou uma modulação diferencial do potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) nas células que superexpressam a proteína tau WT e mutada P301L. Estes resultados sugerem que o DNP não induz toxicidade nas células que superexpressam a proteína tau em concentrações altas e que, apesar de não modular diferencialmente a sinalização de Ca2+ no modelo de tauopatia, estas células apresentam alterações fisiológicas e são mais sensíveis à diminuição do ∆Ψm.