Expressão de miRNAs relacionados com a proliferação de precursores neuronais durante desenvolvimento cerebelar

Abstract

The cerebellum is an important organ to study development in the central nervous system. When matured, the cerebellum presents a well-defined three-layered cortex. Its development initiates during the embryonic period and ends post-natally. The cerebellar granular cells precursors (GCP), that give origin to the most abundant neurons in the cerebellum, have their maturation during the post-natal development. GCP proliferation is induced by the morphogenic factor sonic hedgehog (SHH), which is produced and secreted by the Purkinje cells. SHH signalling pathway activation leads to the transcription of target genes such as the GLI family and MYCN. Overexpression of these factors has been related to medulloblastoma development, a cerebellar tumor that mainly affects children. MicroRNAs (miRNAs) have been frequently related to the regulation of several cellular processes, including proliferation, differentiation and tumor development. Nonetheless, little has been studied about reactive oxygen species (ROS)-induced GCP proliferation, as well as miRNAs expression during the GCP proliferative stage. Our laboratory described a mutant mouse, which presents increases in ROS production as consequence of a Nox3 mutation, named Nox3eqlb. This murine lineage exhibits ataxia; abnormal cerebellar cytoarchitecture caused by an excessive GCP proliferation and disorganized Purkinje cells with underdeveloped dendritic trees. Thus, this project aimed to analyze miRNAs expression predicted to regulate SHH signaling factors during proliferation induced by ROS in GCP. Using bioinformatics strategies to select miRNAs and qPCR to quantify their expression in GCP, we suggested that ROS produced by the NADPH oxidase complex regulate miRNA biogenesis. Mice Nox3eqlb show similar miRNA profile expression during GCP development while we observed variations in miRNAs profile expression on the wild-type mice BALB/c. Furthermore, inhibition of ROS production by NOX through apocynin treatment shows reduction of miRNAs expression timedependent. Thus, we conclude that in GCP, miRNA predicted to regulate SHH signalling factors biogenesis, seems to be related to NOX activity, but how SHH, miRNA and NOX connects is still unclear. Further studies should be done to understand this mechanism of regulation.

O cerebelo maduro possui córtex dividido em três camadas bem definidas que começam a ser formadas durante o período embrionário e com término no período pós-natal. Os precursores de células granulares (PCG), que originam os neurônios mais abundantes do cerebelo, passam por processo de maturação durante o período de desenvolvimento pós-natal. A proliferação de PCG é induzida pelo fator morfogênico sonic hedgehog (SHH), produzido e secretado pelas células de Purkinje. A ativação da via do SHH ativa os fatores de transcrição GLI e MYCN. A superexpressão desses fatores está relacionada ao desenvolvimento de meduloblastoma, tumor cerebelar que acomete principalmente crianças. Os microRNAs (miRNAs) têm papel na regulação de diversos processos celulares, incluindo proliferação, diferenciação e desenvolvimento tumoral. Contudo, pouco tem sido estudado a respeito da proliferação de PCG induzida por espécies reativas de oxigênio (ERO) bem como da expressão de miRNAs durante a fase proliferativa de PCG. Nosso laboratório descreveu um camundongo mutante que apresenta aumento da produção de ERO como consequência de mutação pontual em Nox3, o camundongo Nox3eqlb. Essa linhagem murina exibe fenótipo de ataxia, com citoarquitetura cerebelar anormal devido à proliferação excessiva de PCG e células de Purkinje desorganizadas e com árvores dendríticas pouco desenvolvidas. Este projeto objetivou analisar a expressão de miRNAs preditos de regularem genes alvo da via de sinalização SHH durante proliferação induzida por ERO em PCG. Usando estratégias de bioinformática para selecionar os miRNAs, e qPCR para quantificar a expressão em PCG, sugerimos a ocorrência de uma regulação da biogênese de miRNAs pelas ERO produzidas pelo complexo enzimático NADPH oxidase. Camundongos Nox3eqlb apresentam perfil de expressão similar para todos os miRNAs estudados durante o desenvolvimento, enquanto que observamos diferentes perfis para os diferentes miRNAs expressos pelo camundongo selvagem BALB/c. Adicionalmente, a inibição da produção de ERO pelas NOX por apocinina, mostrou redução da expressão de miRNAs de forma tempo-dependente. Assim, em conclusão, observamos que em PCG, a biogênese dos miRNAs preditos de regularem genes alvo da via do SHH, parece estar relacionada à atividade de NOX, mas ainda é incerto os mecanismos destas interações, sendo necessários novos estudos para desvendá-los.