Análise de diferentes biomateriais como suporte para cultivo de células neurais e células-tronco

Abstract

In the first part of this work we present a methodology for production and application of electrospun hybrid materials containing commercially available polyester (poly-butylene adipate-co-terephthalate; PBAT), and a conductive polymer (polypirrole; PPy) as scaffold for neuronal growth and differentiation. The physical-chemical properties of the scaffolds and optimization of the electrospinning parameters are presented. The electrospun scaffolds are biocompatible and allow proper adhesion and spread of mesenchymal stem cells (MSCs). Fibers produced with PBAT with or without PPy were used as scaffold for Neuro2a mouse neuroblastoma cells adhesion and differentiation. Neuro2a adhered to PBAT and PBAT/PPy2% scaffolds without laminin coating. However, Neuro2a failed to differentiate in PBAT when stimulated by treatment with retinoic acid (RA), but differentiated in PBAT/PPy2% fibers. We hypothesize that PBAT hydrophobicity inhibited proper spreading and further differentiation, and inhibition was overcome by coating the PBAT fibers with laminin. We conclude that fibers produced with the combination of PBAT and PPy can support neuronal differentiation. In the second part of this work we decided to study decellularized biological scaffolds derived from murine brains as another translational approach. Scaffolds composed of extracellular matrix (ECM) are being investigated for their ability to facilitate brain tissue remodeling and repair following injury. Tissue extracellular matrix (ECM) is a complex material made up of fibrous proteins and ground substance (glycosaminoglycans, GAGs) that are secreted by cells. ECM contains important biological cues that modulate cell behaviors, and it also serves as a structural scaffold to which cells can adhere. However the methodologies currently described for decellularizing organs such as the brain involve the use of many chemical reagents with many steps that ultimately limit the process of organ or tissue recellularization. Therefore we describe for the first time a simple, fast method for complete murine brain decellularization. Our results show that in 24h mice brains were completely decellularized, but still maintaining several ECM components essential for cell survival and repopulation of the scaffold. Beyond that we found that the Decellularized Brain Scaffold (DBS) are biocompatible since we showed that Neuro2a cells injected into the DBS and maintained in culture for 24 and 72h could be identified by immunohistochemistry in its undifferentiated form. We conclude that this novel method for murine brain decellularization is efficient and DBS can be used as a biocompatible scaffold for cell repopulation.

Na primeira parte deste trabalho, apresentamos uma metodologia para a produção e aplicação de materiais híbridos contendo poliéster comercial (poli-butileno adipato-co-tereftalato, PBAT) e um polímero condutor (polipirrole, PPy) produzidos pela técnica de eletrospinning, como arcabouço (scaffold) para cultura e diferenciação de neurônios. As propriedades físico-químicas dos substratos e a otimização dos parâmetros de eletrospinning são apresentados. Os scaffolds eletrofiados são biocompativeis e permitem a aderência e proliferação de células-tronco mesenquimais (CTM). As fibras de PBAT com ou sem PPy foram utilizadas como substrato para adesão e diferenciação de células de neuroblastoma (Neuro2a) de camundongo. As Neuro2a aderiram nos scaffolds de PBAT e PBAT / PPy2% sem revestimento de laminina. No entanto, células Neuro2a estimuladas por ácido retinóico (RA), não diferenciaram quando foram cultivadas em PBAT, mas diferenciaram quando cultivadas em fibras de PBAT / PPy2%. Nossa hipótese é que a hidrofobicidade do PBAT tenha inibido a diferenciação, e que a inibição tenha sido superada ao revestir as fibras de PBAT com laminina. Concluímos que as fibras produzidas com a combinação de PBAT e PPy são um bom suporte para a diferenciação neuronal. Na segunda parte deste trabalho, estudamos scaffolds biológicos descelularizados derivados de cérebros murinos como suporte para cultivo de células neurais. Scaffolds compostos de matriz extracelular (MEC) estão sendo investigados por sua capacidade de facilitar a remodelação e reparo do tecido cerebral após uma lesão. A MEC é um material complexo composto por proteínas, glicoproteínas e proteoglicanos, que são secretados pelas células. A MEC contém pistas biológicas importantes que modulam comportamentos celulares, e também serve como um suporte estrutural ao qual as células podem aderir. No entanto, os protocolos descritos atualmente para a descelularização de órgãos, como o cérebro, envolvem o uso de muitos reagentes químicos com muitas etapas que, em última instância, limitam o processo de recelularização. Portanto, descrevemos pela primeira vez um método simples e rápido para a decelularização completa de cérebro murino. Nossos resultados mostram que, em 24h, os cérebros de camundongos foram completamente descelularizados, mas ainda mantiveram vários componentes MEC essenciais para a sobrevivência celular e repovoamento do scaffold. Além disso, observamos que o scaffold descelularizado de cérebro é biocompatível, pois células Neuro2a injetadas no scaffold e mantidas em cultura durante 24 e 72h foram localizadas e identificadas por imuno-histoquímica na sua forma indiferenciada. Concluímos que este novo método para descelularização do cérebro murino é eficiente e os scaffolds podem ser usados como um suporte biocompatível para o repovoamento celular.