Os efeitos do tratamento com esculina sobre a expressão do receptor P2X7 e disfunção mitocondrial na nefropatia diabética experimental

Abstract

Objetivo: Avaliar os efeitos do tratamento com esculina sobre a disfunção mitocondrial e expressão do receptor P2X7 no córtex renal de ratos diabéticos. Métodos: Ratos Wistar machos com 7 semanas de vida e peso entre 170 g — 220 g foram todos uninefrectomizados. Para indução do diabetes, utilizamos estreptozotocina na concentração de 60 mg/kg administrada por via intravenosa. Os animais do grupo controle receberam apenas o veículo da droga, tampão citrato. O diabetes foi confirmado 48 horas após a indução com os animais em jejum de 3 horas, e consideramos positivos os valores de glicemia iguais ou superiores à 200 mg/dL. Animais do grupo controle e diabético foram escolhidos randomicamente para receberem doses diárias de hidrato de esculina na concentração de 50 mg/kg, via gavagem, ou o seu veículo. Os animais foram colocados em gaiolas metabólicas após confirmação do diabetes e na oitava semana de protocolo para coleta de urina de 24 horas e uma pequena alíquota de sangue, coletada via plexo retro-orbital com os animais anestesiados. Ambas as amostras foram usadas para análises bioquímicas de creatinina, ureia, proteinúria e espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico. Terminada a oitava semana de protocolo, os animais foram eutanasiados sob anestesia e o córtex do rim remanescente foi direcionado para análises histológicas; Western blotting, utilizando anticorpos anti-P2X7, anti-calpaína-1 e anti-fator indutor de apoptose (AIF); e também para análises de consumo de oxigênio mitocondrial, realizadas em oxígrafo de alta resolução utilizando substratos dos complexos I (piruvato-malato), II (succinato) e da beta-oxidação (palmitoil-carnitina). Os resultados foram descritos como média ± EP com significância para p < 0,05, onde utilizamos o software GraphPad Prisma 6.0. Resultados: Animais diabéticos apresentaram os sintomas clássicos da doença (poliúria, polifagia, polidipsia e perda de peso), bem como redução na função renal, presença de proteinúria e aumento dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico. O tratamento com esculina não conseguiu reverter estas condições, mas reduziu os achados histopatológicos, como a presença de infiltrados inflamatórios e deposição de colágeno. Animais diabéticos também apresentaram elevação no conteúdo proteico de P2X7 e redução da função mitocondrial. O tratamento com esculina conseguiu reduzir os níveis de P2X7 (-5,46 ± 3,81 vs 15,85 ± 8,88) e reestabeleceu a função mitocondrial à níveis de normalidade ao utilizarmos substratos do completo I (3,08 ± 0,17 vs 2,39 ± 0,08) e da β-oxidação (4,75 ± 0,08 vs 3,68 ± 0,20). Conclusão: Neste estudo, nos animais diabéticos, a esculina não teve efeitos sobre os parâmetros metabólicos, sobre a bioquímica da função renal e não alterou o TBARS. Mesmo não controlando o estresse oxidativo, as proteínas envolvidas na apoptose como o P2X7 e a calpaína encontraram-se reduzidos, resultando em proteção renal vista na histologia, e mais ainda, na melhora da função mitocondrial neste órgão. Deste modo, acreditamos que o prosseguimento deste estudo possa contribuir para controlar a progressão da nefropatia diabética.

Objective: To evaluate the effects of esculin treatment on mitochondrial dysfunction and P2X7 receptor expression in the renal cortex of diabetic rats. Methods: Male Wistar rats with 7 weeks of age and weighing between 170 g — 220 g were all uninephrectomized. For diabetes induction we used intravenous streptozotocin at concentration of 60 mg/kg; IV. Control animals received only the drug vehicle, citrate buffer. Diabetes was confirmed 48 hours by fasting blood glucose values equal or higher than 200 mg/dL. Half of control and diabetic animals were randomly selected to receive daily doses of esculin hydrate, in the concentration of 50 mg/kg via gavage, or its vehicle. The animals were placed in metabolic cages just after the confirmation of diabetes and at the eighth week of protocol for the collection of 24-hour urine and a small aliquot of blood, collected via retroorbital plexus under anesthesia. Both samples were used for biochemical analysis of creatinine, urea, proteinuria and thiobarbituric acid reactive species. After the eighth week of protocol, the animals were euthanized under anesthesia and the remaining kidney cortex was directed for histological examination; Western blotting, using antibodies against P2X7, calpain-1 and apoptosis induction factor (AIF); and also for analysis of mitochondrial oxygen consumption, performed on high resolution oxygraphy using substrates of complexes I (pyruvate-malate), II (succinate) and βoxidation (palmitoyl-carnitine). Results were described as mean ± SE with significance for p < 0.05, with GraphPad Prism 6.0 software. Results: Diabetic animals presented characteristic symptoms of the disease (polyuria, polyphagia, polydipsia and weight loss), as well as reduced renal function, presence of proteinuria and increased levels of thiobarbituric acid reactive species. Treatment with esculin reduced P2X7 levels (-5.46 ± 3.81 vs 15.85 ± 8.88) and restored mitochondrial function to normal levels when we used complex I substrates (3.08 ± 0.17 vs 2.39 ± 0.08) and β-oxidation (4.75 ± 0.08 vs 3.68 ± 0.20). Conclusion: In this study, in diabetic animals, esculin had no effects on metabolic parameters, on the biochemistry of renal function and did not alter TBARS. Even without controlling oxidative stress, proteins involved in apoptosis such as P2X7 and calpain were found to be reduced, resulting in renal protection seen in histology, and even more, in the improvement of mitochondrial function in this organ. Thus, we believe that the continuation of this study with esculin can contribute in the future to control the progression of diabetic nephropathy