Envolvimento de pequenos grupos neuronais seletivamente ativados (neuronal ensembles) do núcleo accumbens em modelos animais relacionados ao desenvolvimento da dependência e à incubação da fissura à cocaína

Abstract

A cocaína, considerando suas diferentes formas (pó, crack e similares), é a segunda droga ilícita mais consumida no Brasil. Em parte dos usuários, o uso contínuo dessa substância leva ao desenvolvimento de transtornos por uso de drogas, comumente conhecidos como dependência, caracterizados pela persistência no uso apesar das consequências negativas. Esse transtorno se manifesta de forma crônica, com episódios recorrentes de recaída. As recaídas podem ser desencadeadas pelo sentimento de fissura que surge após a exposição do indivíduo a estímulos previamente associados ao uso da substância, como pessoas, lugares, objetos utilizados no consumo e até mesmo sensações físicas e emocionais. Esses estímulos também são chamados de pistas ou gatilhos. Em pacientes e modelos animais, foi demonstrado que a fissura desencadeada pelas pistas aumenta nos estágios iniciais da abstinência, um fenômeno conhecido como incubação da fissura. Isso contribui para a alta taxa de recaídas nos primeiros 12 meses de abstinência. Estudos mostram que as recaídas induzidas pelas pistas resultam na ativação seletiva de grupos neurais fortemente conectados e amplamente distribuídos por diferentes regiões do cérebro. Nesse processo, o núcleo accumbens desempenha papel crucial na liberação do comportamento de busca desencadeado pelas pistas. No entanto, muitos estudos desconsideram esse nível de organização, investigando regiões cerebrais de forma abrangente, o que dificulta a identificação e o estudo de adaptações seletivas. O objetivo deste trabalho foi investigar alterações quantitativas, qualitativas e moleculares nos grupos neurais do núcleo accumbens que são seletivamente ativados durante a busca pela cocaína precipitada por pistas. Essa investigação foi realizada em ratos com fenótipo de uso ocasional e compulsivo, bem como após a incubação da fissura, utilizando o modelo de autoadministração de cocaína em ratos. Inicialmente, demonstramos que a duração das sessões de autoadministração afeta o comportamento dos animais, de modo que exposições menores à cocaína (acesso restrito - 1h/dia, 12 dias) resultam em um fenótipo compatível com o uso ocasional, enquanto exposições mais longas (acesso estendido - 6h/dia, 12 dias) levam a um fenótipo compatível com o uso compulsivo. Além disso, apenas os animais submetidos ao acesso estendido manifestaram a incubação da fissura, medida pelo aumento no número de respostas na barra ativa após a abstinência forçada. A ativação neuronal do núcleo accumbens induzida pelas pistas associadas à cocaína, medida pela expressão de Fos, foi maior nos animais com fenótipo compulsivo. Além disso, apenas nesses animais, a ativação induzida pelas pistas aumentou após 30 dias de abstinência forçada. Esse fenômeno foi correlacionado com redução na ativação dos interneurônios PV (parvalbumina positivos) na mesma região. Assim, nossos dados sugerem que o uso compulsivo de cocaína está relacionado a uma maior ativação do núcleo accumbens pelas pistas associadas à cocaína e redução na atividade dos interneurônios PV nessa região. Para investigar se a abstinência afeta a atividade dos interneurônios PV, utilizamos um protocolo de sensibilização locomotora condicionada ao contexto, combinado com fotometria de cálcio em interneurônios PV em camundongos. Nesse protocolo, as pistas foram associadas a injeções de cocaína por 10 dias. Em seguida, após 1 e 10 dias de abstinência forçada, os camundongos foram expostos ao ambiente associado à cocaína, sem a presença da droga. Os registros fotométricos indicaram que a atividade de cálcio nos interneurônios PV evocada pelas pistas diminuiu após a abstinência. Além disso, esse fenômeno foi correlacionado com sensibilização comportamental condicionada ao contexto. Por fim, investigamos como a deleção seletiva dos grupos neurais ativados pelas pistas no primeiro dia de abstinência afetaria a incubação da fissura. Para isso, utilizamos ratos e ratas transgênicos c-fos-LacZ que foram treinados para autoadministrar cocaína sob o regime de acesso estendido. Em seguida, realizamos a deleção por meio da injeção do pró-fármaco Daun02 no núcleo accumbens. A deleção dos grupos neurais especificos potencializou a incubação da fissura, indicando que os grupos neurais ativados no primeiro dia de abstinência não são necessários para a manifestação da incubação da fissura. Em seguida, investigamos se o período de abstinência forçada promoveria alterações moleculares seletivas nos grupos neurais do núcleo accumbens ativados pelas pistas. Para isso, treinamos ratos para autoadministrar cocaína ou sacarina sob o regime de acesso estendido e os expusemos novamente às pistas após 1 ou 30 dias de abstinência. Em seguida, o núcleo accumbens foi dissecado e dissociado, e, por meio da marcação fluorescente para Fos e NeuN, os neurônios ativados foram separados dos inativos por citometria de fluxo. Utilizando rtPCR, quantificamos os níveis de mRNA dos seguintes genes: Hevin, Grin1, Grin2A e receptores muscarínicos do tipo M1. Além disso, a expressão de mRNA para Fos foi utilizada como controle para a separação das células. Para os processos de separação por citometria de fluxo e rtPCR, agrupamos dois animais com comportamento x semelhante para compor cada amostra. A comparação dos níveis de mRNA de Fos entre neurônios ativados e não ativados demonstra a sensibilidade e validade da técnica. Devido ao número amostral não encontramos diferenças entre os grupos para os genes analisados. Em resumo, nossos resultados sugerem que o uso abusivo de cocaína e a incubação da fissura são resultados de maior ativação do núcleo accumbens em resposta às pistas associadas à cocaína, e que esse fenômeno está relacionado a mudanças na atividade dos interneurônios PV e a alterações moleculares seletivas nos neurônios espinhosos médios do núcleo accumbens.

Cocaine, considering its various forms (i.e., powder, crack, and similar), represents the second most consumed illicit drug in Brazil. In some users, the recurrent use of this substance leads to substance use disorders, a phenomenon commonly defined as addiction, and characterized by persistent use despite negative consequences. This disorder manifests chronically, with recurring episodes of relapse. Relapses can be caused by the craving that arises after the individual is exposed to stimuli that were previously associated with substance use, such as people, places, paraphernalia used in drug use, and even physical sensations and emotions. These stimuli are commonly referred to as drug-related cues. In patients and animals, it has been demonstrated that cue-induced craving increases during the early periods of abstinence. This phenomenon is termed incubation of craving. In this context, incubation of craving contributes to the high incidence of relapse of addicts within the first 12 months of abstinence. Studies show that cue-induced relapses result from the selective activation of strongly interconnected neuronal groups widely distributed in different regions of the brain. In this process, the nucleus accumbens is described as highly relevant for triggering the seeking behavior triggered by cues. Although the role of specific neural networks in cue-induced relapse is recognized, many studies disregard this level of organization, conducting investigations on entire brain regions, which makes it difficult to identify and study selective adaptations. This study aimed to investigate quantitative, qualitative, and molecular alterations in grupamentos neuronaisof the nucleus accumbens that are selectively activated during cue-precipitated cocaine seeking. For that, we employed rats with a phenotype of occasional or compulsive drug use, and rats expressing incubation of cocaine craving. To produce this behavioral phenotypes, different cocaine self-administration protocols were used, as described below. In the first chapter, we demonstrated that the duration of self-administration sessions influences the behavioral phenotype of animals, so that shorter cocaine exposures (restricted access - 1 h/day, 12 days) produce a phenotype compatible with occasional use, while longer exposures (extended access - 6 h/day, 12 days) trigger a phenotype compatible with compulsive use. Additionally, only animals subjected to extended access exhibited incubation of cocaine craving, which was measured by the number of active lever responses after forced abstinence. The neuronal activation of the nucleus accumbens induced by cocaine-associated cues, measured by the expression of fos, was higher in animals with a compulsive phenotype. Furthermore, only in these animals, nucleus accumbens cue-induced activation increased after 30 days of forced abstinence. Such increased nucleus accumbens global activation correlated with a reduced activation of parvalbumin-positive interneurons. Thus, our data suggest that compulsive cocaine use is related to increased activation of the nucleus accumbens by cocaine-associated cues. Additionally, we can suggest that incubation of cocaine craving may be related to an increased responsiveness of the nucleus accumbens to drug cues, and this phenomenon depends on a reduction in the activity of parvalbumin-positive interneurons in this region. To explore whether abstinence specifically affects the activity of parvalbumin-positive interneurons, we used a context-specific locomotor sensitization protocol, combined with calcium photometry of parvalbumin-positive interneurons in mice. In this protocol, cues were paired with cocaine injections for 10 days. Then, after 1 and 10 days of forced abstinence, mice were exposed to the environment paired with cocaine without the presence of the drug. Fiber photometric recordings indicated that the calcium activity of parvalbumin-positive interneurons evoked by cues decreased after abstinence. Moreover, this phenomenon correlated with context-specific behavioral sensitization. In our second chapter, we investigated how the selective deletion of cue-activated grupamentos neuronaison the first day of abstinence affects cue-induced craving incubation.