Efeitos da inibição da via autofágica na indução da apoptose e na síntese de espécies reativas de oxigênio em oócitos bovinos expostos à hiperglicemia

Abstract

O diabetes mellitus (DM) é uma das enfermidades que mais acomete a população humana. A hiperglicemia induzida durante o DM provoca severos danos ao sistema reprodutor. Os oócitos apresentam maior propensão a desbalanços metabólicos ou danos ambientais durante a maturação e são excelentes modelos para investigação dos efeitos da hiperglicemia. Já foi demonstrado que concentrações de glicose acima de ~10 mM no meio de maturação in vitro ativa mecanismos de morte celular, como a apoptose, e induz a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Sabe-se que a autofagia atua como um mecanismo de sobrevivência em condições de estresse, entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos deletérios da inibição da autofagia em células germinativas expostas à hiperglicemia. Dessa forma, este projeto fez uso do sistema de maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos como modelo a fim de determinar o papel da autofagia durante a MIV de oócitos expostos à hiperglicemia na síntese de EROs, na progressão meiótica e na indução de apoptose oocitária. Portanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram incubados com o inibidor da autofagia (0 ou 10 mM 3-metiladenina – 3-MA) em meio contendo concentrações de 5,5 (grupo controle) ou 20 mM (grupo hiperglicêmico) de glicose durante 21 horas de MIV. Os CCOs foram desnudados após a MIV e dividido em dois grupos. Para o primeiro experimento, parte dos oócitos foi utilizada para determinação de células apoptóticas pelo ensaio de TUNEL e análise da progressão meiótica para metáfase II (MII). A hiperglicemia e a inibição da autofagia não afetaram a porcentagem de células apoptóticas. No entanto, a presença de 3-MA na MIV reduziu a porcentagem de oócitos em MII nos grupos com 5,5 mM (P= 0,0312) e 20 mM de glicose (P= 0,01410). O segundo experimento determinou os níveis de EROs nos oócitos a partir do ensaio Cell ROX Green. A hiperglicemia aumentou a síntese de EROs em comparação aos demais grupos (P= 0,0029). Além disso, houve uma tendência de aumento da produção de EROs no grupo hiperglicêmico com 3-MA (P= 0,0769). Os resultados indicaram que os oócitos foram comprometidos pela hiperglicemia por meio do aumento do estresse oxidativo e pela inibição da autofagia, reduzindo a maturação nuclear. É possível que esses danos celulares comprometam a qualidade oocitária, reduzindo a fertilidade.

Diabetes mellitus (DM) is one of the diseases that most affects the human population. Hyperglycemia induced during DM causes critical toxicity in the reproductive system. Oocytes are more prone to metabolic imbalances or environmental damage during maturation, hence oocytes at this phase are excellent models for investigating the effects of hyperglycemia. It has already been shown that glucose concentrations above ~10 mM in the in vitro maturation medium activate mechanisms of cell death, such as apoptosis, and induces the formation of reactive oxygen species (ROS). It is known that autophagy acts as a survival mechanism under stress conditions. However, little is known about the deleterious effects of autophagy inhibition in germ cells exposed to hyperglycemia. Thus, this project used the in vitro maturation system (IVM) of bovine oocytes as a model in order to determine the role of autophagy during IVM of oocytes exposed to hyperglycemia in ROS synthesis, resumption of meiosis and oocyte’s apoptosis induction. Therefore, cumulus-oocyte complexes (COCs) were incubated with the autophagy inhibitor (0 or 10 mM 3-methyladenine – 3-MA) in medium containing concentrations of 5.5 (control group) or 20 mM (hyperglycemic group) of glucose for 21 hours of MIV. For the first experiment, the quantification of apoptotic cells by the TUNEL assay and analysis of meiotic progression to metaphase II (MII) were measured. Hyperglycemia and inhibition of autophagy did not affect the percentage of apoptotic cells. However, the presence of 3-MA in MIV reduced the percentage of MII oocytes in the groups with 5.5 (P= 0,0312) and 20 mM (P= 0,01410) of glucose. In the second series of experiment, the ROS levels in oocytes were measured using the Cell ROX Green assay. Hyperglycemia increased ROS synthesis compared to the other groups (P= 0,0029). In addition, there was a tendency towards increased production of ROS in the hyperglycemic group with 3-MA (P= 0,0769). These results indicated that oocytes were compromised by hyperglycemia through increased oxidative stress and by the inhibition of autophagy, that reduced nuclear maturation. It is possible that these cellular damages compromise the oocyte quality, reducing fertility.