Performance do papel Whatman® 903 e a nova membrana de polietileno sulfona para carga viral de HIV-1, resistência genotípica do gene pol (PR e RT) e genotropismo utilizando amostras secas de plasma e sangue

Abstract

Background: Dried blood spots (DBS) and dried plasma spots (DPS) are alternative sample collection types for HIV molecular virology testing. This overrides logistic and technical limitations required for sample collection, handling and transportation. We evaluated HIV viral load (HIV-VL) from DPS, HIV drug resistance (HIV-DR) and genotropism from DPS and DBS in two types of filter membranes. Materials and Methods: For HIV-VL, 55 EDTA preserved plasma samples were spotted (70uL) on Whatman® 903 (903) paper and Polyethylene sulfone membrane (PES) and stored at room temperature overnight. HIV-VL testing for DPS was performed by Abbott m2000 system, 1.0 mL HIV-1 RNA DBS VL IUO v10 Open Mode, protocol modifications and Abbott HIV-1 protocol was used for plasma. Genotyping of 43 EDTA preserved plasma samples with VL≥1000 copies/mL was performed from plasma, DBS-903, DBS-PES, DPS-903 and DPS-PES from patients with virological failure sequencing pol gene and C2V3 region of gp120. Nucleic acid extraction was performed using BOOM technology. HIV-DR was analyzed by Stanford HIVdb and genotropism by Geno2pheno algorithms. Results: Pearson correlation coefficient showed a significant correlation in all viral load measurements; results ranging from 2.9 to 6.8 log10, showing r=0.98, p<0.0001 for DPS-903 versus DPS-PES; r=0.98, p<0.0001 for DPS-PES versus plasma; and r=0.97, p<0.0001 for DPS-903 versus plasma. As compared to plasma samples, the efficacy in obtaining genomic sequences was 95.3% for pol and env using DBS-903, 88.4% for pol and env using DPS-903, 97.7% and 95.3% for pol and env respectively using DBS-PES, 83.7% and 90.7% for pol and env respectively using DPS-PES with no statistical difference between both membranes. The efficacy in obtaining genomic sequences was 95.3% for pol and env using DBS-903, 88.4% for pol and env using DPS-903, whereas it was 97.7% for pol and env using DBS-PES, 83.7% for pol and 94.7% for env using DPS-PES. Tropism assignment concordance between plasma and DPS-903 was 94.7% and 100% for DBS 903, whereas it was 92.5% for DPS-PES and 95.1% for DBS-PES. Conclusion: DPS 903 and the recently described PES are feasible and can be efficacious for HIV viral load determination and both membranes performed very well when DPS or DBS were used for determination of drug resistance or genotropism. Which may well be applied for sample collection and transportation. For sequencing purposes, analysis of DPS and DBS are equally informative.

Introdução: Amostras de sangue secas (DBS) e amostras de plasma secas (DPS) são alternativas como coleta de amostras para testes moleculares para o HIV. Elas transpõem limitações técnicas e logísticas necessárias para coleta de amostras, manuseio e transporte. Avaliou-se a carga viral do HIV-1 (CV-HIV) a partir de DPS, testes de resistência às drogas para o HIV-1 e genotropismo em dois tipos de membranas. Materiais e Métodos: Para a CV-HIV, 55 amostras de plasma em EDTA foram colocadas (70 µL) em papel Whatman® 903 (903) e na membrana de polietileno sulfona (PES) e armazenadas à temperatura ambiente durante a noite. O teste de CV-HIV para plasma foi realizado pelo sistema “Abbott m2000 system, 1.0 mL HIV-1 RNA DBS VL IUO v10 Open Mode” com modificações no protocolo e Abbott HIV-1 protocolo foi usado para o plasma. A genotipagem de 43 amostras de pacientes em falha virológica com carga viral ≥1000 cópias/mL foi realizada pelo método de Sanger, DBS-903, DBS-PES, DPS-903 e DPS-PES foi realizada no gene pol (regiões Protease e Transcriptase Reversa) e região C2V3 da gp120 do gene env. A extração de ácidos nucleicos foi realizada usando a tecnologia BOOM. Os testes de resistência as drogas foram analisados utilizando os algoritmos Stanford HIVdb e o genotropismo pelo Geno2pheno. Resultados: Houve correlação significativa em todas as medidas de carga viral, utilizou-se o coeficiente de correlação de Pearson. Os resultados variaram de 2,9 a 6.8 log10, mostrando r = 0,98, p <0,0001 para DPS-903 versus DPS-PES; r = 0,98, p <0,0001 para DPS-PES versus plasma; e r = 0,97, p <0,0001 para DPS-903 versus plasma. Em comparação com as amostras de plasma, a eficácia na obtenção de sequências genômicas foi de 95,3% para pol e env usando DBS-903, 88,4% para pol e env usando DPS-903, 97,7% para pol e 95.3% para env usando DBS-PES, 83,7 % e 90,7% para pol e env, respectivamente, usando DPS-PES, sem diferença estatística entre as duas membranas. A obtenção de sequências genômicas foi de 95.3% para pol e env usando DBS-903, 88,4% para pol e env usando DPS-903, ao passo que foi 97.7% para pol e env com DBS-PES e 83.7% para pol e 90.7% para env com DPS-PES. A concordância na atribuição de tropismo entre plasma e DPS-903 foi de 94,7% em relação ao perfil de resistência, e 100,0% para o DBS-903, ao passo que foi de 95.2% para o DPS-PES e 95.1% para o DBS-PES. Conclusão: O DPS 903 e o recentemente descrito PES são viáveis e podem ser eficazes para a determinação da carga viral do HIV e as duas membranas tiveram um desempenho muito bom quando DPS ou DBS foram usados para determinação da resistência a medicamentos ou genotropismo. O que pode muito bem ser aplicado para coleta e transporte de amostras. Para fins de sequenciamento, a análise do DPS e do DBS é igualmente informativa.