Evolução temporal nas interações de nanopartículas de ouro ultrapequenas com proteínas

Abstract

Nanopartículas de ouro (AuNPs) ultrapequenas (diâmetro hidrodinâmico < 5-6 nm) têm sido amplamente investigadas nos últimos anos como plataformas mais seguras visando aplicações em nanomedicina. No entanto, em comparação com as AuNPs convencionais de tamanhos maiores, existem relativamente poucos estudos de base in vitro com o objetivo de compreender as interações de AuNPs ultrapequenas com proteínas. Neste trabalho, utilizamos diversas metodologias biofísicas e bioquímicas complementares no estudo das interações entre uma partícula ultrapequena aniônica (AuMBA) e a proteína alfa-trombina, empregadas como modelo de estudo. Por espectroscopia de fluorescência, observamos que o AuMBA interage com a trombina, enquanto experimentos de dicroísmo circular (CD) revelaram que as interações resultaram em alterações na estrutura secundária da proteína. A cinética de associação foi estudada por espectroscopia stopped-flow. A alta taxa de associação, refletida pelo valor kon aparente de ~1x108 M-1s-1, foi próxima do limite de difusão teórico. Já a cinética de dissociação aparente (koff), medida em um fluorímetro, também mostrou-se rápida, com a dissociação total dos complexos ocorrendo em até ~30 s. Resultados de espectroscopia de fluorescência sugeriram a ocorrência de uma pequena alteração irreversível na estrutura terciária global da trombina após 24 h de incubação na presença do AuMBA. Dados de CD após 24 h de incubação também demonstraram modificações irreversíveis na estrutura (secundária) da proteína. Por outro lado, as alterações de estrutura mencionadas se mostraram reversíveis quando o tempo de incubação foi de 10 min. Para avaliar possíveis efeitos das interações no sítio ativo da trombina, a proteína foi marcada com o inibidor reversível e sonda fluorescente DAPA em seu sítio ativo. Resultados de anisotropia de fluorescência sugeriram uma possível alteração no sítio ativo após 24 h de incubação da trombina com o AuMBA. A anisotropia também demonstrou que essas alterações foram completamente revertidas após a dissociação dos complexos. Por outro lado, resultados de ensaios enzimáticos demonstraram a inativação permanente da atividade catalítica da trombina ao longo do tempo de incubação com o AuMBA. Em suma, a abordagem experimental empregada neste trabalho foi capaz de fornecer uma visão geral das interações de AuNPs ultrapequenas com proteínas, incluindo seu impacto na estrutura global e local (sítio ativo), a reversibilidade das alterações estruturais, e os efeitos decorrentes dessas alterações na atividade enzimática. Como próximos passos, a abordagem desenvolvida neste trabalho será refinada e posteriormente aplicada a outros sistemas de interesse.

Ultrasmall gold nanoparticles (AuNPs) (hydrodynamic diameter < 5-6 nm) have been extensively investigated in recent years as safer platforms for nanomedicine applications. However, compared to conventional AuNPs of larger sizes, there are relatively few in vitro-based studies aimed at understanding the interactions of ultrasmall AuNPs with proteins. In this work, we used several complementary biophysical and biochemical methodologies to study the interactions between an ultrasmall anionic particle (AuMBA) and the alpha-thrombin protein, used here as a model system. Using fluorescence spectroscopy, we observed that AuMBA interacts with thrombin, while circular dichroism (CD) experiments revealed that the interactions resulted in changes in protein secondary structure. Association kinetics were studied by stopped-flow spectroscopy. The high association rate, reflected by the apparent kon value of ~1x108 M-1s-1, was close to the theoretical diffusion limit. The apparent dissociation kinetics (koff), measured in a fluorimeter, was also fast, with the total dissociation of the complexes occurring within ~30s. Fluorescence spectroscopy results suggested the occurrence of a small irreversible change in the global tertiary structure of thrombin after 24 h of incubation in the presence of AuMBA. CD data after 24 h of incubation also demonstrated irreversible changes in the (secondary) structure of the protein. On the other hand, the mentioned structure changes were reversible when the incubation time was 10 min. To assess possible effects of interactions on the active site of thrombin, the protein was labeled with the reversible inhibitor and fluorescent probe DAPA at its active site. Fluorescence anisotropy results suggested a possible change in the active site after 24 h of incubation of thrombin with AuMBA. Anisotropy also demonstrated that these changes were completely reversed after dissociation of the complexes. On the other hand, results of enzymatic assays demonstrated the permanent inactivation of the catalytic activity of thrombin over the time of incubation with AuMBA. In summary, the experimental approach employed in this work provided an overview of the interactions of ultrasmall AuNPs with proteins, including their impact on the global and local structure (active site), the reversibility of structural changes, and the resulting effects of these changes on enzymatic activity. In future, the approach developed in this work will be refined and later applied to other systems of interest.