Análise de citocinas e fatores de crescimento secretados por células progenitoras do limbo e ação na modulação da cicatrização corneal in vitro e in vivo

Abstract

The maintenance of corneal epithelium is determined by a distinct population of progenitor cells or stem cells (SC) which is probably located in the basal layer of the corneoscleral limbal epithelium. Various pathologic conditions such as Stevens-Johnson syndrome, scarring pemphigoid and eye burning, can partially or completely destroy the limbal epithelial SC repository giving rise to what is called limbal SC deficiency (LSCD). Ex vivo cultivation and transplantation of limbal epithelial cells has been reported as an alternative source for ocular surface reconstruction. However, until now, the functional improvement of these patients is limited due to the low survival rate of the transplanted cells. Consequently, the clinical benefits of this therapeutic strategy are only temporary and can assign them to paracrine effects associated with the transplanted cells. With this background in mind we aimed to identify the growth factors secreted by limbal SC and analyze its epithelial wound healing action, both in vitro and in vivo. Limbal tissue were obtained from human corneal rims of the remaining trephination of in penetrating keratoplasty. Growth factors secreted by limbal progenitor cells were identified with ELISA and Multiplex in the conditioned medium (CM). For in vitro analysis of epithelial migration, corneal epithelial cells were cultured and treated with previously collected CM, and the epithelial migration were analyzed by inverted microscope and capturing images. In a next step, the necessary parameters were established for the transposition of the experimental to the preclinical model, using topical application of CMs in the corneas of a rat model of limbal stem cells deficiency (LSCD). In the in vitro assays, corneal cells treated with CM of limbal fibroblast medium (CM LF) showed faster migration between 12 and 60h of analysis when compared to fresh medium (MF) treatment. In addition, MC FL was more effective when compared to the other MCs tested. Growth factors analysis showed high concentrations of keratinocyte growth factor (KGF) and hepatocyte growth factor (HGF), factors related to progenitor cells migration and proliferation, in CM LF. In the in vivo experiment, animals treated with CM LF showed improvement of epithelial defect, maintenance of thickness, and decreased opacity and neovascularization. This treatment also allowed better tissue organization of the ocular surface when compared to the other treatments.

A manutenção do epitélio da córnea é determinada por uma população distinta de células progenitoras ou células-tronco (CTs), que estão localizadas na camada basal do límbico córneo-escleral. Uma variedade de condições patológicas, como síndrome de Stevens-Johnson, Penfigoide cicatricial e queimadura ocular, pode destruir as CTs do limbo causando a deficiência das células-tronco do limbo (DCTL). O cultivo e transplante ex vivo de células epiteliais do limbo tem sido relatado como fonte alternativa para a reconstrução da superfície ocular. Porém, até agora, a melhora funcional destes pacientes ainda é limitada, devido à baixa taxa de sobrevivência das células transplantadas. Consequentemente, os benefícios clínicos desta estratégia terapêutica são apenas transitórios e podemos atribuí-los aos efeitos parácrinos associados às células transplantadas. Baseado neste cenário, objetivou-se identificar os fatores de crescimento secretados por CTs do limbo corneal e analisar sua ação na modulação da cicatrização epitelial, tanto in vitro como in vivo. Os tecidos límbicos e corneais foram obtidos a partir de anéis corneoesclerais remanescentes da trepanação de córneas previamente utilizadas em cirurgias de transplante de córnea. Os fatores de crescimento secretados por CTs do limbo foram identificados por ELISA e Multiplex no meio condicionado (MC). Para análise in vitro da migração epitelial, células epiteliais da córnea foram cultivadas e tratadas com o MC previamente coletado de culturas de epitélio límbico, e sua migração foi analisada por microscopia invertida e captura de imagens. Em uma próxima etapa, foram estabelecidos os parâmetros necessários para a transposição do modelo experimental ao pré- clínico com a aplicação tópica de MCs sobre a córnea para o tratamento de DCTL com modelo experimental de ratos. Nos ensaios in vitro, as células epiteliais corneais tratadas com o MC de fibroblastos do limbo (MC FL) apresentaram migração mais rápida e progressiva entre 12 e 60h de análise quando comparado ao tratamento feito com meio fresco (MF). Além disso, o MC FL mostrou-se mais eficaz quando comparado aos demais MCs testados. A dosagem de fatores de crescimentos mostrou altas concentrações de keratinocyte growth factor (KGF) e hepatocyte growth factor (HGF), fatores relacionados à migração e proliferação de células progenitoras epiteliais, no MC FL. No experimento in vivo, os animais tratados com MC FL apresentaram melhora do defeito epitelial, manutenção da espessura e menor índice de opacidade e neovascularização da córnea. Este tratamento também possibilitou melhor organização tecidual da superfície ocular quando comparado aos demais tratamentos testados.