Síndrome da deleção 22q11.2: impacto da deleção na expressão gênica e o papel do gene tbx1 na formação cardíaca em um modelo animal.

Abstract

The 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2DS) results from the loss of a ~3 Mb segment of chromosome 22. The syndrome is characterized by a broad phenotypic spectrum, and the most debilitating clinical signs are psychiatric disorders, immunological deficiency, and mainly congenital heart diseases. Little is known about the role of the 22q11.2 region genes in the phenotype since it varies even among individuals with deletions of similar sizes. On this way, genetic factors lying outside the deleted region may also play a role in the phenotype. In the present work, different research approaches were used to better understand the genetic mechanisms of the syndrome. The evaluation of the transcriptome of patients with 22q11.2DS and control subjects allowed us to identify gene expression alteration of the hemizygous genes, as well as of genes neighboring the deleted region, and of genes mapped on other chromosomes. These findings showed that the deletion may be capable of disrupting the genomic architecture, which results in the gene regulation alteration, even though the gene has a normal copy number. Another aspect studied was the role of the TBX1 (T-box transcription factor) gene, considered to be the most important gene for cardiac morphogenesis among all genes mapped in the 3 Mb region in 22q11.2. The assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing (ATAC-seq) was performed in the embryonic pharyngeal apparatus of mice obtained from Tbx1 transgenic lines, in which the Cre-LoxP recombination system was used for the activation of the green fluorescent protein (GFP) reporter in cells expressing Tbx1. It was possible to observe that the biological processes identified in the population of cells expressing Tbx1 were closely related to cardiac morphogenesis, whereas those processes observed in the cells that did not express Tbx1 were distinct, such as kidney development. In the cell population in which there were overlapping genomic regions identified in both Tbx1-expressing and non-expressing cells, biological processes of general cell maintenance were observed, such as the negative regulation of gene expression. Furthermore, the regulatory regions identified by the methodology presented overlaps with histone modifications frequently observed in promoter and enhancer regions. This strategy facilitates the identification of targets for functional studies as well as help to understand the mechanisms of gene regulation that occur during embryonic development.

A síndrome da deleção 22q11.2 (SD22q11.2) é causada por uma perda de um segmento de aproximadamente 3 Mb de um dos cromossomos 22. A síndrome é caracterizada por um amplo espectro fenotípico, sendo que os sinais clínicos mais debilitantes para os pacientes são as alterações psiquiátricas, deficiência imunológica e, principalmente, as doenças cardíacas congênitas. Pouco se sabe sobre o papel dos genes da região 22q11.2 no fenótipo e, uma vez que o fenótipo varia mesmo entre indivíduos com deleções de tamanhos semelhantes, fatores genéticos fora da região deletada podem também exercer um papel no quadro clínico. No presente trabalho, foram utilizadas diferentes abordagens de pesquisa para a melhor compreensão dos mecanismos genéticos da síndrome. A avaliação do transcriptoma de pacientes com a SD22q11.2 e de indivíduos controle permitiu que identificássemos a alteração da expressão dos genes em hemizigose, bem como de genes vizinhos à região deletada e ainda de genes mapeados em outros cromossomos. Esses achados evidenciam que a deleção pode ser responsável pelo rompimento da arquitetura genômica, o que resulta na alteração da regulação da expressão de genes em número normal de cópias. Outro aspecto estudado foi o papel do gene TBX1 (T-box transcription factor), considerado o gene mais importante para a morfogênese cardíaca entre todos os genes mapeados na região de 3 Mb em 22q11.2. O ensaio da cromatina acessível à transposase seguido por sequenciamento de nova geração (ATAC-seq - do inglês, assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing) foi realizado no aparelho faríngeo de embriões de camundongos provenientes de linhagens transgênicas para o gene Tbx1, em que o sistema de recombinação Cre-LoxP foi utilizado para a ativação da proteína repórter verde GFP (green fluorescent protein) em células que expressavam Tbx1. Foi possível observar que os processos biológicos identificados na população de células que expressavam Tbx1 estavam intimamente relacionados à morfogênese cardíaca, enquanto que aqueles processos observados nas células que não expressavam Tbx1 eram distintos, como o desenvolvimento dos rins. Na população de células em que havia sobreposição de regiões genômicas identificadas tanto nas células que expressavam Tbx1 como naqueles que não o expressavam, processos biológicos de manutenção geral das células foram observados, como a regulação negativa da expressão gênica. Ainda, as regiões regulatórias identificadas apresentavam sobreposição com marcas de histonas frequentemente observadas em regiões promotoras e de enhancers. Essa estratégia facilita a identificação de alvos para estudos funcionais, bem como pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de regulação gênica que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário.