Caracterização dos efeitos celulares e moleculares de EHT- 1864, um inibidor de RAC, em células de leucemia mieloide aguda

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a hematological neoplasm caused by molecular changes in the hematopoietic stem- and progenitor cells, leading to the accumulation of undifferentiated myeloid cells with higher proliferation capacity (blasts). The presence of blasts in the bone marrow compromises hematopoiesis and blasts can affect peripheral blood and infiltrate other tissues and organs, such as lung and nervous system. AML is highly heterogeneous and standard treatment is nonspecific, resulting in low survival rates, especially in the elderly. Thus, it is essential to investigate new therapeutic targets that may result in the development of more effective and specific therapies. The Rho family of GTPase proteins is composed by twenty cytoskeleton regulators that have been shown to participate in the physiopathology of hematological neoplasms. Our preliminary results showed that the expression of Rac3 is increased in AML. In addition, the expression of Rho GTPase Rac2 is associated with lower survival of AML patients. However, little is known about the participation of these Rho GTPases in the physiopathology of this disease. The aim of this study was to evaluate the effects of EHT-1864, an inhibitor of the Rac subfamily of Rho GTPases (Rac1, Rac2 and Rac3) on AML cells. For this, we evaluated the processes of apoptosis, autophagy and cell cycle in a AML cell line treated in vitro with EHT-1864. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway was also evaluated, as well as the effects of the combination of EHT- 1864 and daunorubicin on the apoptosis. Pharmacological inhibition of Rac reduced the viability of OCI-AML3, KG1 and Kasumi1 cells in a time and dose-dependent manner. In OCI-AML3 cells, treatment with EHT-1864 for 48 and 72 hours induced apoptosis and autophagy processes and led to an accumulation of the percentage of cells in the G1 phase of the cell cycle, with consequent reduction in phase S. The changes in the cell cycle were concomitant with the change in the expression of p53 and cyclins (reduction of cyclins A and E and increase of cyclin B). In addition, we observed lower activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway in OCI-AML3 cells treated with EHT-1864. Interestingly, the combined treatment of EHT-1864 and low doses of daunorrubicin in vitro enhanced OCI-AML3 cell apoptosis. This study demonstrates the antitumor capacity of EHT-1864 against AML cell lineage, including potentiating effect when9 used in combination with daunorubicin. Our results suggest that the observed effects are at least partly dependent on PI3K/AKT/mTOR inhibition.

A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica causada por alterações moleculares nas células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, levando ao acúmulo de células mieloides indiferenciadas com maior capacidade de proliferação (blastos). A presença dos blastos na medula óssea compromete a hematopoiese e os blastos podem acometer o sangue periférico e infiltrar outros tecidos e órgãos, como pulmão e sistema nervoso. A LMA é altamente heterogênea e o tratamento padrão é inespecífico, resultando em baixas taxas de sobrevida, principalmente em idosos. Assim, é imprescindível a investigação de novos alvos terapêuticos que possam resultar no desenvolvimento de terapias mais efetivas e específicas. A família de Rho GTPases é composta por vinte proteínas reguladoras do citoesqueleto que têm mostrado participação na fisiopatologia de neoplasias hematológicas. Nossos resultados preliminares mostraram que a expressão da Rho GTPase Rac3 está aumentada em LMA. Além disso a maior expressão de Rac2 está associada a menor sobrevida de pacientes com LMA. Porém, pouco se sabe sobre a participação destas Rho GTPases na fisiopatologia desta doença. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de EHT-1864, um inibidor de membros da subfamília Rac de Rho GTPases (Rac1, Rac2 e Rac3) em células de LMA. Para isso, avaliamos os processos de apoptose, autofagia e ciclo em linhagens celulares tratadas in vitro com EHT-1864. A via de sinalização PI3K/AKT/mTOR também foi avaliada, bem como os efeitos da combinação do tratamento de EHT-1864 e daunorrubicina na apoptose de células leucêmicas. A inibição farmacológica de Rac reduziu a viabilidade de células OCI-AML3, KG1 e Kasumi1 de forma dependente de tempo e de dose. Em células OCIAML3, o tratamento com EHT-1864 por 48 e 72 horas induziu os processos de apoptose e autofagia e levou a um acúmulo da porcentagem de células na G1 do ciclo celular, com consequente redução na fase S. As modificações no ciclo celular foram concomitantes à alteração na expressão de p53 e ciclinas (redução de ciclinas A e E e aumento de ciclina B). Além disso, observamos menor ativação da via PI3K/AKT/mTOR nas células OCI-AML3 tratadas com EHT-1864. Interessantemente, o tratamento in vitro combinado de EHT-1864 e baixas doses de daunorrubicina potencializou a apoptose de células OCI-AML3. Este estudo demonstra a capacidade antitumoral de EHT-1864 contra linhagem celular de LMA, inclusive com efeito7 potencializador quando utilizado em combinação com daunorrubicina. Nossos resultados sugerem que os efeitos observados sejam pelo menos em parte dependentes da inibição da via PI3K/AKT/mTOR.