Avaliação da relação entre ritmos biológicos e fisiologia dos lisossomos e sua participação em modelo de doença lisossômica

Abstract

The clock system is responsible for the orchestration observed in several physiological, cellular and molecular processes. This regulation is controlled by a molecular machinery that allows the ideal synchronization of each tissue to the organism and this control presents plasticity that ensures the adaptation of the system to environmental changes. Lysosomes, organelles responsible for cellular digestion, present circadian activities and the role of the clock system is being explored in Lysosomal Storage Diseases, in which oxidative stress has a participation in their pathophysiologies and is regulated by the clock system. Despite these information, the relation between lysosomes and clock system in poorly understood. Thus, the aim of this work was to evaluate consequences of lysosomal malfunction, induced by drug or genetic disorder, in clock system and redox state. Rat fibroblasts with the gene Bmal1 conjugated to luciferase were treated with lysosomal inhibitors at the peak and trough of Bmal1 expression for Bmal1 expression and superoxide dismutase (SOD1) analysis; rat cardiomyocytes were treated at the peak of expression of Bmal1 for clock genes expression and autophagy-related proteins analysis and; control individuals and Fabry Disease (FD) patients? fibroblasts were used for clock genes and antioxidant enzymes genes expression evaluation, SOD1 and LAMP-2 protein expression and verify if the GLA gene, mutated in FD, and ?-galactosidase A enzyme (?-gal A), deficient if FD, present circadian oscillation. Results obtained indicated that the lysosomal inhibition by drugs promotes phase advance or delay and period alterations in Bmal1 expression, depending on the moment of treatment ? peak or trough of Bmal1 expression; besides acute modifications in Bmal1 and Per1, clock genes, and, phosphorylated-AMPK and LC-3 expression, proteins involved in autophagy. FD patients? fibroblasts presented altered expression of clock genes, especially from the positive arm of regulation (BMAL1 and CLOCK); GLA gene presented circadian oscillation and ?-gal A seemed to be influenced by the clock system. Redox state regulation was altered by lysosomal inhibition by drugs, in FD patients? fibroblasts the antioxidant enzymes genes and SOD1 did not present compromised clock system regulation but the protein LAMP-2 had alterations of its rhythmicity in FD patients? cells. Based on all these analysis, we suggest that lysosomal inhibition, acute or chronic, promotes alterations in the molecular regulation of the clock system likely related to the increase of cytosolic calcium. Therefore, we concluded that lysosomes have a role in the regulation of clock system and redox state, and hypothesize that this may happen through calcium mobilization from the interior of these organelles to the cytosol.

O sistema de temporização tem o papel de orquestrar a temporalidade observada em diversos processos fisiológicos, celulares e moleculares. Essa regulação é realizada por uma maquinaria molecular que permite a sincronização ideal de cada tecido ao organismo e seu controle apresenta plasticidade que garante a adaptação do sistema às mudanças ambientais. Os lisossomos, organelas responsáveis pela digestão celular, apresentam atividades circadianas e o papel do sistema de temporização vem sendo explorado em Doenças de Depósito Lisossômico, nas quais o estresse oxidativo participa de suas patofisiologias e também é regulado pelo sistema de temporização. Apesar dessas informações, a relação entre os lisossomos e o sistema de temporização é pouco conhecida. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar as consequências do mau funcionamento lisossômico, induzido por droga ou defeito genético, no sistema de temporização celular e no estado redox. Fibroblastos de ratos com o gene Bmal1 conjugado à luciferase foram tratados durante o pico e vale da expressão do gene com drogas inibidoras de lisossomo e utilizados para análise de expressão de Bmal1 e da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD1); cardiomiócitos de ratos tratados durante o pico de expressão de Bmal1 foram utilizados para avaliação da expressão de genes relógio e de proteínas envolvidas na autofagia e; fibroblastos de indivíduos controle e pacientes com Doença de Fabry (DF) foram utilizados para analisar expressão de genes relógio, de genes de enzimas antioxidantes e expressão das proteínas SOD1 e LAMP-2 além de verificar se o gene GLA, mutado na DF, e a enzima ?-galactosidase A (?-gal), deficiente na DF, apresentam oscilação circadiana. Os resultados obtidos indicaram que a inibição lisossômica realizada com drogas promoveu avanço ou atraso de fase e alterações no período da expressão de Bmal1, a depender do momento do tratamento ? pico ou vale da expressão de Bmal1 e; promoveu alterações agudas na expressão dos genes Bmal1 e Per1 e na expressão das proteínas AMPKfosforilado e LC-3, envolvidas no processo de autofagia. Os fibroblastos de pacientes com DF apresentaram alterações de expressão de genes relógio, principalmente do braço positivo de regulação (BMAL1 e CLOCK); o gene GLA apresentou oscilação circadiana e a enzima ?- gal A foi influenciada pelo sistema de temporização. A regulação do estado redox, por sua vez, foi alterada com a inibição lisossômica promovida por drogas, em fibroblastos de pacientes com DF os genes de enzimas antioxidantes e a enzima SOD1 não mostraram ter sua ritmicidade comprometida e a proteína LAMP-2 apresentou alterações de ritmicidade em células de pacientes com DF. A partir das análises realizadas, sugerimos que a inibição lisossômica promove alterações na regulação molecular do sistema de temporização possivelmente relacionadas com o aumento de cálcio no citosol. Assim, concluímos que os lisossomos apresentam um papel na regulação do sistema de temporização e do estado redox, e sugerimos que isso deve ocorrer pela mobilização de cálcio do interior dessas organelas para o citosol.