Características fenotípicas e genéticas relacionadas à Brazilian Klebsiella carbapenemase - BKC-1

Abstract

Klebsiella pneumoniae is a widely reported pathogen causing different types of infections, which has been highlighted by the increased levels of antimicrobial resistance. Among the mechanisms of resistance, the production of carbapenemases has a significant clinical impact since infections caused by carbapenem-resistant K. pneumoniae can lead to the outcome of infected patients. The objective of this study was to determine the microbiological and genetic characteristics of BKC-1 -producing bacterial isolates. The present thesis was subdivided into five articles made during the doctorate period. Article 1: BKC-1 is a new class A carbapenemase. It was recently reported in K. pneumoniae clinical isolates collected from the State of São Paulo. This study aimed to investigate the frequency of in clinical isolates of Klebsiella spp. harboring blaBKC-1.Six hundred and thirty-seven clinical isolates of Klebsiella spp. from hospitals located in the five Brazilian regions were investigated. Among them, only two were identified as BKC-1 producers. These isolates were also detected in hospitals located in the State of São Paulo, and belonged to ST442 and ST1781, respectively, which were grouped under CC442. The isolates presented the multi-drug resistant phenotype, with the presence of different resistance mechanisms. One of these isolates was resistant to polymyxins due to mgrB disruption by an IS. Both strains carried a small plasmid, which was identical to the original plasmid described in 2015. Article 2: Due to weak hydrolytic activity of BKC- 1 towards carbapenems, this study was carried out to compare the performance of distinct phenotypic test for detection of BKC-1-producing isolates. Traditional tests such as THM, DDST-AFB were not able to detect the production of this carbapenemase among the isolates tested. In contrast, the colorimetric tests Carba- NP, Blue-carba and Carbapenembac were able to detect such isolates as carbapenemase producers. More laborious tests such as detection of hydrolysis by MALDI-TOF MS and spectrophotometry showed good performance for detecting BKC-1 activity. Article 3: Based on the manuscript published by Partridge (2016), article 3 was written. It is a response letter to the genetic findings proposed by the Partridge regarding to the association among blaBKC-1, aph3a-VI and ISKpn23. Article 4: Due to the lack of knowledge of the genetic mechanisms involved in the acquisition and mobilization of blaBKC-1, mobilization (conjugation and transposition) and expression experiments were performed with the objective of determining the role of ISKpn23 in mobilization and expression of the blaBKC-1. The experiments demonstrated that ISKpn23 was able to modulate the expression of the blaBKC-1, contributing to the increase of the β-lactam MICs. On the other hand, ISKpn23 did not modulate aph3a-VI expression. Additionally, experiments evidenced the mobilization ability of pA60136 by conjugation, but did not to elucidate how the blaBKC- 1 was genetically engineered. Article 5: Despite the rare reports of isolated BKC-1 producers in Brazil, the objective of this study was to report the silent spread of a BKC-1 producing K. pneumoniae ST442 clone as well as the acquisition of blaBKC-1 by a hypervirulent K. pneumoniae clone, ST11. These isolates were characterized microbiologically. This dissemination occurred in a university hospital located in the city of São Paulo for approximately 3 years (2010-2012). In this period, 16 isolates producers of BKC-1 were recovered with the presence of a majorities clone (A1 / ST442; in 15 isolates) belonging to ST442. In six of the sixteen isolates the coproduction of BKC-1 and KPC-2 was identified.

Klebsiella pneumoniae é um patógeno largamente reportado causando diferentes tipos de infecções, que vem se destacando pelo aumento nos níveis de resistência. Dentre os mecanismos de resistência, a produção de carbapenemases apresenta grande destaque, pelo impacto clínico que as infecções causadas por K. pneumoniae produtoras de carbapenemases podem acarretar no desfecho de pacientes infectados. O objetivo deste estudo foi determinar as características microbiológicas e genéticas de isolados bacterianos produtores da carbapenemase BKC-1. A presente tese foi subdividida em cinco artigos realizados durante o doutorado. Artigo científico 1: Recentemente descrita, a carbapenemase BKC-1 foi reportada em isolados clínicos de K. pneumoniae no Estado de São Paulo. Este estudo teve como objetivo, investigar a frequência desta enzima em isolados clínicos de Klebsiella spp. provenientes de diferentes estados brasileiros. Seiscentos e trinta e sete isolados clínicos provenientes das cinco regiões brasileiras foram investigados. Dentre estes isolados, apenas em dois deles foi identificada a produção de BKC-1. Estes isolados também foram detectados em distintos hospitais do Estado de São Paulo e pertenciam aos ST442 e ST1781 que compõem o CC442. Os isolados apresentaram fenótipo de multirresistente, com a presença concomitante de diferentes mecanismos de resistência. Um dos isolados apresentou resistência às polimixinas devido a inserção de uma IS no gene mgrB, que levou à inativação do mesmo. Também foi possível detectar que ambos os isolados apresentavam o mesmo plasmídeo carreando o gene blaBKC-1, o qual era idêntico ao originalmente descrito em 2015. Artigo científico 2: Pelo fato da BKC-1 apresentar fraco poder hidrolítico frente aos carbapenens, este estudo avaliou comparativamente a performance dos testes fenotípicos utilizados para a detecção de carbapenemase para a triagem de amostras produtoras de BKC-1. Testes tradicionais, como o THM, DDST-AFB não foram capazes de detectar a presença de BKC-1 entre os isolados testados. Por outro lado, os testes colorimétricos Carba-NP, Blue-carba e Carbapenembac foram capazes de identificar a produção da carbapenemase BKC-1 nos isolados testados. Testes laboratoriais mais laboriosos como detecção da hidrólise por MALDI-TOF MS e espectofotometria também foram eficientes na detecção da atividade da BKC-1. Artigo científico 3: Baseado no manuscrito publicado por Partridge (2016), o artigo 3 é uma carta resposta aos achados genéticos propostos pela autora sobre a associação do gene blaBKC-1 com aph3a-VI e a ISKpn23. Artigo científico 4: Devido ao desconhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos com a aquisição e a mobilização de blaBKC-1, experimentos de mobilização (conjugação e transposição), e expressão foram realizados com o objetivo de determinar o papel da ISKpn23 na mobilização e na expressão do gene blaBKC-1. Os experimentos demonstraram que a ISKpn23 foi capaz de modular a expressão do gene blaBKC-1, contribuindo para o aumento das CIMs aos β-lactâmicos. Por outro lado, a ISKpn23 não modula expressão do gene aph3a-VI. Adicionalmente, experimentos de transposição evidenciaram a capacidade de co-mobilização do pA60136 por conjugação, mas não foram capazes de elucidar como se dá a movimentação genética do gene blaBKC-1. Artigo científico 5: Apesar dos raros relados de isolados produtores de BKC-1 no Brasil, o objetivo deste estudo foi relatar a disseminação silenciosa de um clone epidêmico de K. pneumoniae ST442 produtor de BKC-1 bem como a aquisição de blaBKC-1 por um clone de K. pneumoniae hipervirulento, ST11. Estes isolados foram caracterizados microbiologicamente. A disseminação ocorreu em um hospital universitário localizado na cidade de São Paulo durante aproximadamente três anos (2010-2012). Neste período, 16 isolados produtores de BKC-1 foram recuperados com a presença de um clone majoritário (A1/ST442; em 15 isolados) pertencente ao ST442. Em seis dos dezesseis isolados foi identificada a coprodução de BKC-1 e KPC-2.