Caracterização de tipos de SCCmec de Staphylococcus aureus resistente à meticilina por PCR multiplex e sequenciamento de nova geração

Abstract

Background: The mecA gene is included in a genomic element designed as staphylococcal cassette chromosome mec – SCCmec, with 14 decribed types, integrated to S. aureus chromosome and located near its replication origin. Multiplex PCR methods have been utilized to characterize SCCmec types. Objective: To evaluate PCR multiplex methods and NGS (New Generation Sequencing) to characterize methicillin/oxacillin resistant S. aureus SCCmec in nosocomial Brazilian isolates. Methods: MRSA nosocomial isolates from 2002 to 2009 from the Brazilian Scope Study were studied by PFGE (Pulsed Field Gel Electrphoresis) and MLST (Multi Locus Sequencing Typing). SCCmec were characterized by multiplex PCR following the Zhang (2005) and Kondo (2007) protocols. The NGS was done by the MiSeq Sequencing System (Illumina). Results: 41 MRSA samples were evaluated by multiplex PCR and 16 showed discordant results. 11 of these discordant isolates were analysed by PFGE and MLST. Two of these 11 that maintained discordant results were selected for NGS. One isolate carried mec complex type A and ccrAB4 (characteristic of SCCmec type VIII) and AB3 (characteristic of SCCmec type III), and the other isolate carried mec complex type A and ccrAB4 (characteristic of type VIII) and AB2 (characteristic of type II). Conclusion: For the Brazilian reality, the multiplex PCR developed by Zhang could be considered a good option for SCCmec screening of the MRSA dissemination. NGS was helpful to identify SCCmec types not well defined by the multiplex PCR utilized in the study. Two isolates showed two ccr complexes and characterized as probable type VIII not yet described in our country.

Introdução: O gene mecA faz parte de um elemento genômico designado cassete estafilocócico do cromossomo mec (staphylococcal cassette chromosome mec - SCCmec), com 14 tipos descritos, integrado ao cromossomo de S. aureus e localizado próximo à sua origem de replicação. Metodologias de PCR multiplex têm sido utilizadas para caracterização de SCCmec. Objetivos: Avaliar as metodologias de PCR multiplex para os tipos predominantes de SCCmec no Brasil em Staphylococcus aureus resistentes a meticilina/oxacilina; caracterizar tipos de SCCmec inseridos em nosso contexto hospitalar utilizando sequenciamento de nova geração. Material e Métodos: Estudo de isolados de MRSA do período de 2002 a 2009 provenientes do Brazilian Scope Study. Os isolados foram caracterizados pela metodologia de PFGE e MLST. Os tipos de SCCmec foram identificados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex segundo protocolo de Zhang de 2005 e Kondo de 2007. Sequenciamento de genoma completo (WGS) de duas amostras selecionadas foi realizado no equipamento MiSeq Sequencing System (Illumina Inc., USA). Resultados: Foram avaliados 41 isolados hospitalares de MRSA. Ao comparar resultados dos dois protocolos multiplex utilizados, 16 amostras mostraram resultados discordantes entre si. Onze amostras deste subgrupo foram escolhidas analisadas por PFGE. Duas amostras que persistiram com resultados discrepantes foram submetidas à MLST e NGS (sequenciamento de nova geração). Resultados destas metodologias revelaram que uma amostra carreava complexo mec tipo A e ccrAB4 (característico de SCCmec tipo VIII) e AB3 (característico de SCCmec tipo III); e outra amostra carreava complexo mec tipo A e ccrAB4 (característico de tipo VIII) e AB2 (característico de tipo II). Conclusão: Para a realidade brasileira, o protocolo de PCR multiplex desenvolvido por Zhang e colaboradores, pode ser considerado ainda uma boa opção para realização de screening dos tipos de SCCmec circulantes em isolados de MRSA. A utilização do NGS para identificar tipos de SCCmec auxiliou na elucidação de tipos não bem definidos pelos métodos de PCR multiplex utilizados. A utilização do NGS foi útil para confirmar a presença de MRSA contendo mais de um tipo de complexo ccr. O presente estudo revelou a presença de provável SCCmec tipo VIII inserido em nosso contexto hospitalar e até então não descrito em nosso país.