Lacasas: un enfoque “In Silico” para la inactivación de antibióticos comúnmente utilizados en humanos y animales

Abstract

Las lacasas (Lac, E.C 1.10.3.2) pertenecen a la superfamilia de las cupredoxinas, familia de las oxidasas multicobre azul. Actualmente son de gran importancia ambiental e industrial, ya que catalizan la oxidación de una gran cantidad de compuestos recalcitrantes que contaminan el ambiente. Los antibióticos son contaminantes emergentes, considerados los segundos fármacos en incidencia en medios acuáticos a nivel mundial. La persistencia de los antibióticos en el medio ambiente en concentraciones subletales genera un grave problema, ya que favorece la adaptación y la proliferación de bacterias multirresistentes. El objetivo de este trabajo fue simular computacionalmente el uso de las lacasas GlLCC 1 de Ganoderma lucidum y POXA 1B de Pleurotus ostreatus en la degradación de antibióticos de uso humano y animal. Para esto, se generó un modelo basado en el molde de la lacasa producida por el hongo Lentinus tigrinus y se determinó la calidad del modelo mediante el cálculo del QMEAN (0.78). Igualmente, el modelo fue validado con el fin de evaluar la calidad de la estructura; superando los umbrales de calidad esperados para cada análisis. El siguiente paso fue la parametrización de los cobres del centro activo y el análisis de las variaciones estructurales (en ausencia de ligandos) a lo largo de la etapa de producción de la dinámica molecular; las estructuras de GILCC 1 y POXA 1B fueron estables durante toda la trayectoria (200 ns), (RMSD y RMSF <2 Å). Para el estudio se seleccionaron 16 antibióticos (ligandos), de importancia crítica según la OMS, con uso aprobado por diferentes entidades regulatorias (FDA, INVIMA, ICA), de amplio espectro y con un peso molecular entre 100 y 500 Da. Se evaluó la interacción molecular con los modelos 3D de las enzimas GILCC 1 y POXA 1B y los ligandos a pH 3.0 y 7.0. Ambos modelos 3D presentaron mayor afinidad por los ligandos a pH 3.0, lo que coincidió con los análisis experimentales que ha realizado el grupo de investigación, cuando determinaron el pH óptimo para la actividad de las lacasas rGILCC 1 y rPOXA 1B, utilizando ABTS como sustrato. Los valores de energía libres de unión indicaron una mayor afinidad entre el modelo 3D de GILCC 1 y los ligandos y una afinidad menor entre el modelo 3D de POXA 1B y los ligandos. Los resultados más bajos de energía libre de Gibbs (ΔG) indicaron mayor afinidad a pH 3.0 entre GILCC 1 con levofloxacina (LVX; -8.2 Kcal mol-1 ), sulfisoxazol (FIS; -7.8 Kcal mol-1 ), cefuroxima (CXM ; -7.5 Kcal mol-1 ), cefradina (BAN; -7.5 Kcal mol-1 ), ABTS (-7.6 Kcal mol-1 ) y tetraciclina (TE; -7.5 Kcal mol-1 ). Los resultados de GILCC 1 pueden explicarse por la topología del bolsillo 9 y el gran número de interacciones (puentes de hidrógeno e interacciones de van der Waals) que se forman entre la enzima y los antibióticos. Es posible que la transferencia de electrones en GILCC 1 ocurra por medio de una cadena de residuos de aminoácidos que incluye la His395 y la Phe239. A pesar de que a pH 7.0 la afinidad entre los antibióticos y GILCC 1 fue menor que a pH 3.0, no se descarta la posibilidad de que la lacasa pueda degradar los antibióticos a pH 7.0; por lo que se recomienda evaluar experimentalmente la degradación de los antibióticos con GILCC 1 a pH 7.0 en presencia de un mediador como el ABTS, para tratar de incrementar la afinidad entre las moléculas. Para POXA 1B a pH 3.0 los resultados más bajos de ΔG indicaron mayor afinidad por cefazolina (CZ; -6.8 Kcal mol-1 ), levofloxacina (LVX; - 6.3 Kcal mol-1 ), linezolid (LZD; -6.3 Kcal mol-1 ), ABTS (-6.7 Kcal mol-1 ) y tetraciclina (TE; -6.4 Kcal mol-1 ). La interacción entre los grupos ionizables de los antibióticos y ciertos aminoáciodos claves de POXA 1B como la His458, la Phe238 y el Asp206, facilitaron la transferencia de electrones hasta el centro activo para dar inicio a la degradación. A pH 7.0, no fue posible parametrizar la enzima ya que se formó un enlace entre la Cis451 y la His395 del centro activo, esta conformación no es la correcta, ni es coherente con la estructura reportada para las lacasas, por lo que no se presentan los resultados de acoplamiento ni de dinámica con POXA 1B a pH 7.0. Sin embargo, la parametrización de este modelo a pH 7.0 sigue en estudio por el grupo de investigación. Los complejos enzima-ligando más estables fueron evaluados por dinámica molecular; estos fueron inmersos en una caja de aguas TIP3P y se evaluó el comportamiento del sistema a 300 K. Se realizó la simulación de equilibrio y producción utilizando un ensamblaje isotérmico-isobárico (NPT). Los resultados de la dinámica molecular mostraron una alta estabilidad de los complejos GILCC 1-ligando a pH 3.0. GILCC 1 mostró que la Tetracilina (TE), la cefuroxima (CXM), la levofloxacina (LVX) y la cefradina (BAN) tenían una interacción estable con el centro activo y sólo el antibiótico sulfisoxazol (FIS) se salía del bolsillo a los 4.0 ns. El análisis del MMGBSA confirmó la estabilidad de los complejos. Estos resultados promisorios, sugieren que GILCC 1 puede degradar los antibióticos tetraciclina (TE), levofloxacina (LVX), cefuroxima (CXM) y cefradina (BAN) a pH 3.0. 10 En el modelo 3D de POXA 1B, sólo la cefazolina (CZ) permaneció en el bolsillo del modelo, mientras que la tetraciclina (TE), la levofloxacina (LVX) y el linezolid (LZD) se salieron a los 7.4, 40.2 y 19.6 ns, respectivamente. La estructura del modelo 3D de POXA 1B presentó regiones de alta fluctuación cercanas al bolsillo de unión, lo que explicaría la salida de la mayoría de los ligandos. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de que POXA 1B pueda degradar estos antibióticos, pues la presencia de un mediador podría contribuir a la estabilidad del sistema. Este estudio computacional predijo de forma acertada el comportamiento de un sistema lacasa antibiótico. Es una representación a nivel atómico de las interacciones moleculares que pueden darse bajo condiciones reales entre las lacasas y los antibióticos y significa un complemento para los estudios a nivel práctico. Se sugiere validar experimentalmente estos resultados y evaluar la degradación en presencia de diferentes compuestos químicos que pueden encontrarse en aguas residuales. Además, se sugiere realizar estudios de mutagénesis para evaluar si los aminoácidos de POXA 1B, que presentaron altas fluctuaciones (Val162 y Ser264) afectan la degradación de los antibióticos