Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016.O álcool combustível tem adquirido importância nos últimos anos devido ao futuro esgotamento das reservas de combustíveis fósseis, bem como o impacto ambiental pela emissão de poluentes que estes combustíveis fósseis apresentam. Uma atrativa fonte de matéria prima para a obtenção de etanol é a biomassa lignocelulósica, composta de lignina, celulose e hemicelulose, sendo que estes dois últimos polímeros podem ser utilizados nos processos fermentativos para a produção de álcool combustível. Embora a levedura industrial Saccharomyces cerevisiae fermente eficientemente hexoses, esta levedura é incapaz de fermentar pentoses como a xilose, o principal açúcar presente nos hidrolisados de hemicelulose. A enzima xilose redutase (XR) é o primeiro passo no metabolismo da xilose, uma enzima NAD(P)H-dependente que reduz xilose a xilitol, mas o desbalanço causado pela xilitol desidrogenase dependente de NAD+ (a segunda enzima do metabolismo da xilose) pode levar ao acúmulo de xilitol. Então, a seleção de XRs com alta atividade enzimática e afinidade pelos dois cofatores é importante para o aumento da produtividade de etanol a partir da xilose. No presente trabalho foram clonados genes que codificam para possíveis XRs de duas leveduras do gênero Spathaspora (S. passalidarum e S. arborariae), e também foi clonada uma xilitol desidrogenase de S. passalidarum, ambas leveduras naturalmente fermentadoras de xilose. Estes genes foram expressos em uma linhagem de S. cerevisiae para avaliar a funcionalidade das enzimas. Nossos resultados mostraram que um gene anotado no genoma de S. arborariae (também presente em S. passalidarum) como XR, não exibiram atividade com este açúcar, e provavelmente trata-se de aldo-ceto redutases com especificidades desconhecidas. Outro gene foi amplificado de S. arborariae e S. passalidarum, e quando expressos em S. cerevisiae, o gene de S. arborariae apresentou atividade XR com ambos os cofatores (NADH e NADPH), enquanto que o gene obtido de S. passalidarum só exibiu atividade de XR dependente de NADPH. A atividade da xilitol desidrogenase clonada de S. passalidarum, quando expressa em S. cerevisiae, mostrou uma enzima completamente dependente de NAD+. Linhagens de S. cerevisiae recombinantes, expressando as diferentes enzimas do metabolismo da xilose clonadas no presente trabalho, foram capazes de crescer e consumir xilose, porém com baixa produção de etanol, e significativa produção de xilitol. Isto provavelmente se deve a baixa atividade da enzima xilitol desidrogenase nas linhagens recombinantes. De fato, mesmo nas fermentações de xilose em batelada, as células recombinantes produziram mais xilitol do que etanol. Finalmente, durante co-fermentações de xilose/glicose, as leveduras recombinantes produziram mais xilitol e acetato do que etanol a partir da xilose, indicando que provavelmente o desbalanço de cofatores ainda esta determinando o destino dos carbonos provenientes da xilose. Portanto, nossos resultados indicam a presença de diferentes xiloses redutases no genoma das leveduras Spathaspora, que poderão contribuir para otimizar a produção de etanol de segunda geração.<br>Abstract : The production of fuel álcohol has become importante in recente years due to the future depletion of fóssil fuels stocks and the environmental impact of pollutant emissions. An attractive source of raw material for etanol production is the lignocellulosic biomass, composed of lignina, celulose and hemicellulose. The sugar cane bagasse is an interesting source of celulose and hemicelulose, that can be used in the fermentative process for fuel alcohol production. Although the industrial yeast Saccharomyces cerevisiae efficiently ferments hexoses, this yeast is unable to ferment pentoses such as xylose present in hemicellulose hydrolysates. The enzyme xylose reductase (XR) is the first step in xylose metabolism, a NAD(P)H-dependent enzyme that reduces xylose to xylitol, but cofactor imbalance with the NAD+-dependent xylitol dehydrogenase (the second enzyme in xylose metabolism) can lead to xylitol accumulation. Thus, screening for XR with high catalytic efficiency and dual cofactor affinity is important for increasing the ethanol productivity from xylose. This work, we have cloned xylose reductases from strains of Spathaspora (S. passalidarum and S. arborariae) and cloned xylitol dehydrogenase from Spathaspora passalidarum, which are natural xylose fermenting yeast. These genes were expressed in the S. cerevisiae strain CENPK2-1C to avaliate the enzymes functionality. Our results showed that a gene annotated in the S. arborariae genome (present in S. passalidarum) as xylose reductase does not have activity with this sugar, and probably is a putative aldo-keto reductase of unknown specificity. Another gene was amplified from S. arborariae and S. passalidarum, and when these genes were expressed in S. cerevisiae a xylose reductase enzymatic activity with both NADH and NADPH were observed with the S. arborariae gene, but in the case of the S. passalidarum gene we obtained a NADPH-dependent xylose reductase activity. The activity of xylitol dehydrogenase expressed in S. cerevisiae was completely NAD+-dependent. S. cerevisiae recombinants, enconding the different enzymes of xylose metabolismo, was able to grow on xylose with a xylose comsumption, low yield of ethanol and significative xylitol production. It presumably due the low expression of xylitol dehydrogenase and incresing XR/XDH ration activity. Indeed, in xylose batch fermentation the recombinant cells were able to produce more xylitol than ethanol and xylose/glucose batch fermentation, the recombinant cells produce more xylitol and acetate than ethanol from xylose, that probably indicating the cofactor unbalance determining the carbons from xylose fate. Thus, our results indicate the presence of several different xylose reductases in the genome of Spathaspora yeast could be a contribution to optimize the second-generation ethanol.