La modificación de los enlaces disulfuro en las proteínas (escisión, formación e isomerización) es asistida por una creciente familia de proteínas denominadas protein disulfuro oxidoreductasas (PDOR). El mecanismo de acción de estas enzimas se basa en la rápida velocidad con la cual los residuos cisteína de su sitio activo (-Cys-X-Y-Cys-) llevan a cabo los intercambios tiol-disulfuro con los grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro de las proteínas sustrato. En el presente trabajo se desarrolló un novedoso procedimiento para determinar la actividad de las PDORs (Capítulo 1) y se purificó a homogeneidad y se caracterizó tanto estructural, como cinéticamente, la Protein Disulfuro Isomerasa (PDI) de colza (Brassica napus) (Capítulo 2). El método desarrollado para la medición continua de la actividad de las PDORs se basa en la escisión de los enlaces disulfuro de la insulina derivatizada en sus extremos amino terminales con una sonda fluorescente (fluoresceína). La velocidad del incremento en la fluorescencia de la "di Insulina-fluoresceintiocarbamilada" (di Ins-FTC) es lo suficientemente sensible para estimar concentraciones de Tiorredoxina (Trx) de E. coli desde 5 nM hasta 500 nM. Además, el ensayo permite estudiar, empleando reductores no-fisiolólogicos (DTT), el efecto del pH sobre la actividad de estas enzimas sin la interferencia de enzimas accesorias (e.g. NADP-Trx-reductasa). Utilizando este ensayo, se purificó por primera vez, una PDI de semillas de una planta dicotiledónea. Los estudios estructurales revelaron que la PDI de colza es una glicoproteína homodimérica (57 kDa la subunidad) sustituida con un solo oligosacárido del tipo alta manosa. La PDI es estable a la desnaturalización térmica, y la presencia del oligosacárido no alteraría su estabilidad. Sin embargo, la remoción del oligosacárido disminuyó un 60% la actividad reductasa de la PDI. La PDI cataliza tanto la formación, la escisión como la isomerización de los enlaces disulfuro en varias proteínas sustrato. Dos factores son fundamentales en estas reacciones de intercambio tiol-disulfuro: a) el pH y b) el potencial redox del medio. El empleo de la di Ins-FTC como sustrato para medir la actividad reductasa de la PDI y de la Trx, permitió determinar que a pesar de compartir un sitio activo característico y una similitud estructural, ambas enzimas poseen pH óptimos distintos. La Trx cataliza esta reacción a pH neutro o ligeramente alcalino, mientras que la PDI lo hace más eficientemente a pH levemente ácido. Sin embargo, cuando se analizó la efectividad de la PDI en la catálisis de la formación y de la isomerización de las cistinas, la mayor eficiencia se obtuvo a pH levemente alcalinos. Por otra parte, a potenciales redox equivalentes a los que existirían dentro del retículo endoplásmico, la PDI acelera tanto la formación como la isomerización de los enlaces disulfuro. Pero a potenciales más reductores, estas actividades disminuyen y aumenta la capacidad para escindir estos enlaces. Estos estudios sugieren que tanto el pH intracelular, como los niveles de GSH reducido y oxidado (potencial redox) pueden modular la tendencia a la formación o a la escisión de los enlaces disulfuros cuando la PDI es el catalizador. Finalmente, la PDI de colza fue efectiva en la reducción de los enlaces disulfuro de una proteína de reserva presente en la semilla de colza: la napina. Estos resultados en conjunto, sugieren que la PDI podría proveer una vía alternativa para la reducción de varias proteínas presentes en la semilla, además de la ya propuesta para la Trx-h, en los eventos tempranos de la germinación.