Tesis
Estudios estructurales y cinéticos de variantes de la fructosa-1,6- bisfosfatasa de los cloroplastos de trigo generadas en Escherichia coli
Autor
Hagelin, Karin
Institución
Resumen
La Fructosa-1,6-bisfosfatasa de los cloroplastos (CFBPasa) de las plantas superiores es un homotetrámero de peso molecular c.a 160000 que cataliza la siguiente reacción: fructosa 1,6-bisfosfato + H2O----> fructosa 6-fosfato + Pi Mg2+ (o Mn2+) La actividad CFBPasa es modulada por la luz, tal como ocurre con otras enzimas regulatorias del cloroplasto. La actividad de la enzima aumenta luego de la transición oscuridad-luz debido a que ocurre (a) un aumento del pH y de la concentración de Mg2+ en el estroma del cloroplasto, (b) la modificación de otros metabolitos y iones del cloroplasto y (c) la reducción de grupos -S-S- de la enzima. La influencia de la luz se debe al efecto del Sistema de Transporte de Electrones mediado por el Sistema Ferredoxina-Tiorredoxina. In vitro, la actividad de la CFBPasa es modulada por componentes tanto fisiológicos (tiorredoxina) como no fisiológicos (cosolventes, aniones caotrópicos, alta presión). Los cambios conformacionales inducidos por estos moduladores son los responsables del aumento de su actividad específica. A fin de analizar las características cinéticas y estructurales de la enzima, el gen de la CFBPasa de los cloroplastos de trigo fue subclonado en el plásmido pGEX-1. La expresión del gen de la proteína de fusión conteniendo a la Glutation-S-transferasa en su extremo N-terminal y a la CFBPasa de trigo en el C-terminal produjo los cuerpos de inclusión. En consecuencia, la CFBPasa particionó en la fracción insoluble del lisado bacteriano. Con esta suspensión fue analizado el proceso de recuperación de las propiedades funcionales de la CFBPasa mediante técnicas de desnaturalización y resolubilización de proteínas. Además se estudió el efecto de moduladores -fisiológicos y no fisiológicos- y de anticuerpos sobre la reconstitución de las actividades CFBPasa como Glutation-S-transferasa en la proteína quimérica. En contraste con las CFBPasas homotetraméricas obtenidas de otras fuentes, la capacidad catalítica residía en un dímero. A fin de caracterizar a la enzima de cloroplastos y comparar su comportamiento con el de la CFBPasa contenida en la proteína de fusión, la secuencia nucleotídica que codifica para la CFBPasa de trigo fue clonada y expresada en otro vector: el plásmido pET-22. Este plásmido condujo a la obtención de la enzima libre del fragmento GST, en la fracción soluble del lidado bacteriano. A partir del mismo, la CFBPasa fue purificada a homogeneidad y caracterizada estructural y cinéticamente. Al igual que las contraparte de otros orígenes, la CFBPasa de trigo era un homotetrámero activable por reductores (ditiotreitol) y moduladores fisiológicos (tiorredoxina) y no-fisiológicos (perturbantes proteicos). De particular interés en estos estudios fue que la ausencia de 20 aminoácidos de la región N-terminal de la CFBPasa no afectara la capacidad catalítica de la enzima. De manera que una región altamente variable en las FBPasas, cloroplásticas y no cloroplásticas, no tendría participación en el mecanismo catalítico.