Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013O malation é um composto tóxico pertencente à classe dos pesticidas organofosforados (OF) que tem como mecanismo primário de ação inibir a enzima acetilcolinesterase (AChE), levando à clássica síndrome colinérgica. No entanto, estudos vêm demonstrando que a neurotoxicidade decorrente da exposição crônica a esta classe de pesticidas pode ocorrer sem sintomas colinérgicos antecedentes e parece não depender da inibição da enzima AChE. Quanto ao tratamento da intoxicação aguda por esses compostos, a eficácia das oximas clinicamente disponíveis (por exemplo, pralidoxima), utilizadas para reativar a AChE inibida, tem sido questionada. Dessa forma, o primeiro objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da pralidoxima e de uma oxima experimental (K074) na reativação da AChE após exposição aguda ao malation, bem como na prevenção de possíveis alterações bioquímicas relacionadas com o estresse oxidativo induzidas pelo malation, utilizando camundongos Swiss. O malation (1,25 g/kg, s.c.) induziu uma diminuição significativa da atividade da AChE no córtex pré-frontal, hipocampo e sangue dos animais 24 h após uma única injeção. Após os tratamentos com as oximas (1/4 da DL50, i.m., 6 h após a exposição ao malation), foi observado que a pralidoxima (66 mg/kg) foi capaz de reverter significativamente a inibição da AChE sanguínea, enquanto que a oxima K074 (5,8 mg/kg) não teve efeitos de reativação em relação à enzima sanguínea. Interessantemente, ambas as oximas testadas foram incapazes de reativar a AChE inibida pelo malation no córtex pré-frontal e no hipocampo após a injeção intramuscular ou intracerebroventricular (1/4 de DL50, 6 h após a exposição ao malation). Os parâmetros bioquímicos relacionados com o estresse oxidativo (atividade das enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase e catalase, bem como os níveis de peroxidação lipídica) não foram afetados nos animais tratados com malation, oximas ou atropina. No entanto, quando a pralidoxima e K074 foram administradas por via intramuscular 6 h após a exposição ao malation, estas oximas foram capazes de aumentar a atividade das enzimas antioxidantes no córtex pré-frontal e hipocampo. Estes resultados indicam que as atividades da AChE periférica e central não estão necessariamente correlacionadas após o tratamento com malation/oximas, além disso, considerando que os tratamentos disponíveis na clínica para a intoxicação com malation não parecem eficazes, este estudo reforça a necessidade de busca por novos reativadores da AChE capazes de reativar eficientemente a enzima sanguínea e cerebral após o envenenamento com malation. O próximo objetivo do trabalho foi investigar os efeitos de administrações repetidas (ao longo de um período de 15 dias) com doses de malation que não causam toxicidade colinérgica, sobre o desempenho cognitivo (relacionado à memória), bem como alterações bioquímicas no hipocampo de camundongos adultos. Os tratamentos com malation (30 e 100 mg/kg, pela via subcutânea) não afetaram o peso corporal dos animais durante o período experimental, além disso, não foram observados sinais evidentes de toxicidade colinérgica durante todo o período de tratamento. Apenas a dose de 100 mg/kg de malation foi capaz de inibir significativamente a atividade da AChE hipocampal após um período de tratamento de 15 dias; no entanto, esta inibição não produziu sinais aparentes de toxicidade. Ao final do tratamento de 15 dias, os animais expostos ao malation (30 e 100 mg/kg) mostraram uma diminuição significativa na capacidade de memória espacial, a qual foi acompanhada por uma diminuição da atividade do complexo I mitocondrial, aumento da expressão das proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak, bem como ativação astroglial no hipocampo. Por outro lado, os níveis de sinaptofisina (marcador de sinapses), de colina acetiltransferase (marcador de neurônios colinérgicos) e de aquaporina4 (proteína associada com disfunção da barreira hematoencefálica) não foram alterados pelo tratamento com malation. O déficit no teste de memória espacial de curto prazo causado pela exposição dos animais a 30 mg/kg de malation, dose que não causou inibição da atividade da AChE hipocampal, indica a possibilidade de acontecimentos não colinérgicos relacionados com a modulação da performance cognitiva nestes animais. A partir dos resultados obtidos neste trabalho, sugere-se que o mecanismo envolvido no déficit de memória induzido pela exposição ao malation pode ser mediado, pelo menos em parte, por uma interação sinérgica entre disfunção mitocondrial e processos neuroinflamatórios. Finalmente, a partir de estudos in vitro com cultura primária de neurônios corticais, investigou-se os possíveis mecanismos que precedem a morte celular induzida pela exposição prolongada ao malaoxon. O tratamento com malaoxon 100 µM foi capaz de causar significativa morte das células corticais no dia in vitro 6 (6DIV) e significativa inibição da atividade da AChE nos tempos que precederam a morte celular (0,5 h; 24 h e 48 h). Além disso, observou-se um aumento significativo da produção de espécies reativas de oxigênio e uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial nos primeiros 60 min de exposição das células a 100 µM de malaoxon. O pré-tratamento das culturas com o antioxidante ácido ascórbico foi capaz de proteger parcialmente, embora significativamente, da morte celular induzida pela exposição prolongada ao malaoxon. Os nossos resultados indicam que a morte das células neuronais corticais expostas ao malaoxon pode estar associada com indução de estresse oxidativo. No entanto, estudos adicionais são necessários para elucidar os mecanismos envolvidos com a toxicidade do malaoxon neste tipo de cultura, bem como a participação da AChE nestes eventos <br>The organophosphorus (OP) pesticide malathion is a highly neurotoxic compound and its toxicity is primarily caused by the inhibition of acetylcholinesterase (AChE), leading to cholinergic syndrome. However, studies have shown that the neurotoxicity resulting from OP chronic exposure can occur without previous cholinergic symptoms and they do not appear to be dependent on AChE inhibition. Regarding the treatment of OP acute poisoning, the clinical experience with the available oximes (e.g. pralidoxime) is disappointing and their routine use has been questioned. Thus, the first aim of this study was to investigate the potency of pralidoxime and K074 in reactivating AChE after acute exposure to malathion, as well as in preventing malathion-induced changes in oxidative-stress related parameters in mice. Malathion (1.25 g/kg, s.c.) induced a significant decrease in cortico-cerebral, hippocampal and blood AChE activities at 24 h after exposure. Oxime treatments (1/4 of LD50, i.m., 6 h after malathion poisoning) showed that pralidoxime (66 mg/kg) significantly reversed malathion-induced blood AChE inhibition, although no significant effects were observed after K074 treatment (5,8 mg/kg). Interestingly, both oximes tested were unable to reactivate the cortico-cerebral and hippocampal enzymes after intramuscular or intracerebroventricular injection (1/4 of LD50, 6 h after malathion poisoning). Biochemical parameters related to oxidative stress (cerebro-cortical and hippocampal glutathione peroxidase, glutathione reductase and catalase activities, as well as lipid peroxidation) were not affected in animals treated with malathion, oximes or atropine alone. However, pralidoxime and K074, administered intramuscularly 6 h after malathion poisoning, were able to increase the endogenous activities of these antioxidant enzymes in the prefrontal cortex and hippocampus. These results indicate that peripheral and central AChE activities are not necessarily correlated after the treatment of OP compounds and/or oximes. In addition, considering that the available treatments to malathion poisoning appear to be ineffective, the present study reinforce the need to search for potential new AChE reactivators able to efficiently reactivate the brain and blood AChEs after malathion poisoning. The next aim of this study was to investigate the effects of repeated subtoxic doses of malathion (over a 15-days period) on cognitive performance as well as biochemical changes in the hippocampus of adult mice. The treatments with malathion (30 and 100 mg/kg, subcutaneously) did not affect the body weight of animals throughout the experimental period, furthermore, no evident signs of cholinergic toxicity were observed throughout the treatment. The highest dose of malathion (100 mg/kg) was associated with significant AChE inhibition in the hippocampus after a 15-days treatment period, however, this inhibition did not produce signs of cholinergic toxicity. At the end of treatments, malathion-exposed animals (30 and 100 mg/kg) showed a significant impairment on learning-memory ability which was paralleled by a significant decrease in the mitochondrial complex I activity, increase in the levels of proapoptotic proteins (Bax and Bak) and astroglial activation (increase in the level of GFAP), in the hippocampus. On the other hand, the levels of synaptophysin (a specific synaptic marker), choline acetyltransferase (a marker of cholinergic neurons) and aquaporin 4 (a protein related with blood-brain barrier dysfunction), were not affected by the treatment with malathion. The short-term spacial memory deficit observed after the exposure to 30 mg/kg dose of malathion, that caused no hippocampal AChE inhibition, indicates the possibility that cholinergic events are not related with the modulation of the cognitive performance in these animals. From the results obtained in this study, we suggest that the cholinergic system may not be involved in the malathion-induced neurotoxic effects, in addition, we suggest that the mechanism involved in the spacial memory deficit induced by repeated malathion exposure can be mediated, at least in part, by a synergistic interaction between mitochondrial dysfunction and neuroinflammatory processes. Finally, we investigated the possible molecular events that precede malaoxon-induced cell death in cultured neuronal cortical cells. The treatment with 100 µM of malaoxon was able to cause significant death of cortical cells on day in vitro 6 (DIV6) and significant AChE inhibition in the times preceding the cell death (0.5 h, 24 h and 48 h). In addition, there was a significant increase in the production of reactive oxygen species and a decrease in mitochondrial membrane potential in the cells exposed to malaoxon. Pretreatment with the antioxidant ascorbic acid displayed a protective effect against malaoxon-induced neurotoxicity in the cortical neuronal cells. Our data indicate that the neuronal cortical cell death induced by malaoxon may be associated with induction of oxidative stress. However, additional studies are needed to elucidate the mechanisms involved in the malaoxon toxicity in these cells, as well as the involvement of AChE in these events.