Establecimiento de relaciones de cruzabilidad y genómicas en el germoplasma silvestre de maní

Abstract

La extensa variabilidad que presentan las especies silvestres del género Arachis constituye una invaluable fuente de genes de interés agronómico. Sin embargo, su uso en programas de mejoramiento del maní es limitado debido al escaso conocimiento sobre la biología reproductiva de las mismas, asi como del efecto de la composición genómica, diferencias cromosómicas y distancia genética en la capacidad de generar híbridos viables y fértiles entre las especies. Por lo tanto, en esta tesis se planteó como objetivo general analizar las relaciones genómicas y de cruzabilidad entre especies representativas de los genomas A, B y K, con el fin de incrementar el conocimiento básico de las especies silvestres e incentivar su uso en la resolución de problemas agronómicos del maní. Para tal fin se diseñó un sistema de cruzamientos que incluyó todas las combinaciones híbridas intra e intergenómicas posibles entre seis especies de la sección Arachis representativas de los genomas A (A. kempff-mercadoi, A. helodes), B (A. williamsii, A. valida) y K (A. batizocoi, A. cruziana). Además, se incluyeron controles para evaluar la eficiencia reproductiva de las especies mediante la capacidad de formar semillas por autofecundación (control A), y los efectos introducidos mediante la manipulación manual de las flores utilizando la técnica de castración y polinización con polen de la misma especie, en la formación de semillas (control B). Los análisis de eficiencia reproductiva de las especies parentales (control A), revelaron que las especies silvestres presentan diferencias en el sistema reproductivo, con variaciones en la producción de semillas por autogamia. Esta diferencia probablemente esté asociada con diferencias en la transferencia efectiva del polen a la superficie estigmática. Por otro lado, las polinizaciones artificiales (control B) aumentaron o mantuvieron la eficiencia reproductiva de las especies permitiendo descartar un efecto negativo de la manipulación de las flores, y sustentando que una mejora en la transferencia de polen en la naturaleza mejoraría la eficiencia reproductiva en algunas especies. El análisis de las relaciones de cruzabilidad se realizó utilizando la efectividad relativa corregida con la eficiencia reproductiva de cada especie. Los resultados de los cruzamientos intragenómicos evidenciaron eficiencias dispares en las combinaciones recíprocas y que A. batizocoi (KK), A. williamsii (BB) y A. helodes (AA) presentaron mayores efectividades de hibridación como progenitores femeninos. Estas serían las mejores candidatas para ser utilizadas en planes de hibridación con otras especies del mismo genoma. Los resultados de los cruzamientos intergenómicos entre especies A y K, revelaron que A. batizocoi presentó mejor comportamiento como progenitor femenino en polinizaciones con A. helodes, mientras A. cruziana lo hace con A. kempff mercadoi. En cruzamientos entre A. williamsii y especies del genoma A no se evidenciaron incompatibilidades diferenciales entre las especies. Arachis helodes presentó mejor comportamiento que la especie anual en los cruzamientos con A. cruziana (K) y A. valida (B), siendo las únicas combinaciones en las que la especie perenne tuvo mejor comportamiento que la anual como progenitor femenino. Para las combinaciones entre especies anuales, los resultados demostraron que A. batizocoi y A. williamsii se desempeñaron mejor como progenitores femeninos, constituyendo las mejores especies con genoma B y K, de las seleccionadas, para generar híbridos y anfidiploides. Estos resultados demostraron que la efectividad de hibridación interespecífica tiene relación directa con la eficiencia reproductiva de las especies utilizadas como progenitores femeninos, la combinación genómica y la dirección del cruzamiento. Por otro lado, la comparación de las efectividades de hibridación relativa, y del análisis de los caracteres vegetativos y reproductivos de los híbridos permitieron inferir que la capacidad de cruzabilidad estaría influenciada por distintas barreras de aislamiento reproductivo precigóticas (como la transferencia de polen al estigma, polinización y fertilización efectiva), y barreras postcigóticas tempranas (aquellas asociadas al desarrollo del embrión). Los híbridos obtenidos en 25 combinaciones evidenciaron que estas barreras se manifiestan con distinto grado entre los pares de especies, aunque con mayor intensidad en los cruzamientos intergenómicos. Las afinidades genómicas entre las especies seleccionadas fueron inferidas, en primer término, mediante el análisis de las configuraciones meióticas, del comportamiento meiótico desde profase I hasta ana-telofase II, del índice meiótico y de la viabilidad del polen en los híbridos intra e intergenómicos obtenidos. Las diferentes frecuencias de bivalentes, univalentes y multivalentes observadas, demuestran distintos grados de homologías cromosómicas entre los pares de especies. Los malos apareamientos cromosómicos y las diferencias estructurales se manifestaron en diversas anomalías en el comportamiento meiótico. Los índices

12 meióticos, relativamente altos en todos los híbridos, no reflejaron los desbalances cromosómicos numéricos y/o estructurales esperados. Sin embargo, los valores de viabilidad del polen, menores a los esperados, sugieren que la sobrevida del polen estaría afectada, no sólo por las diferencias en homología cromosómica, sino que también por incompatibilidades génicas que se expresan en el gametofito haploide. Las distancias genéticas entre las especies parentales se evaluaron utilizando polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) mediante la plataforma Axiom Arachis 48K. Los resultados mostraron que la distancia mayor se encuentra entre las especies de los genomas B y A, y que las del genoma K se encuentran en una posición intermedia entre estas, aunque más cercanas a las del genoma B. El análisis de correlaciones pareadas de las variables analizadas en esta tesis mostró que la distancia genética presenta una baja e inversa relación con la efectividad de hibridación de las especies. Esto sugiere que las diferencias en las secuencias de ADN, por sí solas, no serían un buen estimador de la capacidad de generar híbridos interespecíficos. Esta baja relación evidencia que las barreras de aislamiento reproductivo precigótico y poscigótico tempranas, determinadas probablemente por pocos genes, tienen una gran influencia sobre la efectividad de hibridación. Por otra parte, la baja relación existente entre la distancia genética y la frecuencia de bivalentes, índice meiótico y viabilidad del polen, sugiere que la fertilidad de los híbridos estaría influenciada por diferencias / incompatibilidades postcigóticas en al menos dos niveles de organización del material genético, la cromosómica y la génica expresada a nivel de gametofito haploide. La evaluación integral de diversas variables asociadas a barreras reproductivas permitió estimar la contribución diferencial de las homologías cromosómicas y distancia genética a la factibilidad de obtener híbridos viables y fértiles entre especies de Arachis. En conjunto, la información obtenida demuestra que ninguna de las variables evaluadas de forma independiente constituye un buen predictor de la cruzabilidad de las especies y que es imprescindible considerar otras variables, principalmente las asociadas con el aislamiento precigótico y postcigótico temprano. Se propone que la extensión de estos análisis integradores a las demás especies que integran el germoplasma secundario del maní será de relevancia para optimizar los criterios de selección de parentales para cruzamientos dirigidos y para promover el uso de las especies silvestres de Arachis en programas de mejoramiento.

The vast variability of Arachis wild species is an invaluable source of agronomic interest genes. However, their use in peanut breeding programs is limited due to the scarce knowledge of their reproductive biology, as well as the effect of genomic composition, chromosomal differences and genetic distance on the ability to generate viable and fertile hybrids between species. Therefore, the main objective of this thesis was to analyze the genomic and crossability relationships between representative species of the A, B and K genomes, in order to enhance the basic knowledge of wild species and encourage their use in the resolution of agronomic problems of peanut.

With this purpose, a crossing system was designed including all possible intra- and intergenomic hybrid combinations between six species of section Arachis

representing genomes A (A. kempff-mercadoi, A. helodes), B (A. williamsii, A. valida) and K (A. batizocoi, A. cruziana). Additionally, we included controls to evaluate the reproductive efficiency of the species through the ability of forming seeds by self-fertilization (control A), and the effects introduced by manual manipulation of flowers using the technique of emasculation and pollination with pollen of the same species, on the formation of seeds (control B). The reproductive efficiency analysis of the parental species (control A) revealed that the wild species show differences in the reproductive system, with variations in seed production by autogamy. This difference is probably associated to differences in the effective transfer of pollen to the stigmatic surface. Furthermore, artificial pollination (control B) increased or maintained the reproductive efficiency of the species, allowing us to rule out a negative effect of flower manipulation, and supporting that an improvement in pollen transfer in the wild would enhance reproductive efficiency in some species. The analysis of the crossability relationships was performed using the relative effectiveness corrected with the reproductive efficiency of each species. The results of the intragenomic crosses evidenced dissimilar efficiencies in the reciprocal combinations and that A. batizocoi (KK), A. williamsii (BB) and A. helodes (AA) exhibit higher hybridization efficiencies as female parents. These would be the most suitable candidates to be used in hybridization schemes with other species of the same genome.

14 The results of intergenomic crosses between A and K species revealed that A. batizocoi performed better as a female parent in pollination with A. helodes, while A. cruziana performed better with A. kempff-mercadoi. In crosses between A. williamsii and species of the A genome, no differential incompatibilities were observed between the species. Arachis helodes performed better than the annual species in crosses with A. cruziana (K) and A. valida (B), thus resulting the only combinations in which the perennial species performed better than the annual species as female parent. Regarding the combinations between annual species, the results showed that A. batizocoi and A. williamsii performed better as female parents, representing the best selected species with B and K genome for generating hybrids and amphidiploids. These results demonstrated that the effectiveness of interspecific hybridization is directly related to the reproductive efficiency of the species used as female parents, the genomic combination and the crossing direction. The comparison of relative hybridization efficiencies and the analysis of vegetative and reproductive characters of the hybrids allowed inferring that the crossability capability could be influenced by different prezygotic reproductive isolation barriers (such as pollen transfer to the stigma, pollination and effective fertilization), and early postzygotic barriers (those associated with embryo development). The hybrids obtained in 25 combinations evidenced that these barriers are manifested with varying degrees between pairs of species, although with greater strength in intergenomic crosses. Genomic affinities between the selected species were first inferred from the

analysis of meiotic configurations, meiotic behavior from prophase I to ana- telophase II, meiotic index and pollen viability in the intra- and intergenomic hybrids

obtained. The differing frequencies of bivalents, univalents and multivalents observed indicate different degrees of chromosomal homologies between the pairs of species. Chromosomal mispairings and structural differences were manifested in diverse abnormalities in meiotic behavior. Meiotic indexes, relatively high in all hybrids, did not reflect the expected numerical and/or structural chromosomal imbalances. However, values of pollen viability, lower than expected, suggest that pollen survival would be affected not only by differences in chromosomal homology, but also by gene incompatibilities expressed in the haploid gametophyte.

15 Genetic distances between the parental species were evaluated using single nucleotide polymorphisms (SNPs) with the Axiom Arachis 48K platform. The results revealed that the greatest distance is found between the species of the B and A genomes, and that those of the K genome are in an intermediate position between them, although closer to those of the B genome. The paired correlation analysis of the variables analyzed in this thesis revealed that genetic distance has a low and inverse relation with the hybridization effectiveness of the species. This suggests that differences in DNA sequences alone would not be a reliable estimator of the capability to generate interspecific hybrids. This low relationship evidences that prezygotic and early postzygotic reproductive isolation barriers, probably determined by a few genes, have a strong influence on hybridization effectiveness. Otherwise, the low relationship between genetic distance and bivalent frequency, meiotic index and pollen viability suggest that hybrid fertility would be influenced by postzygotic differences/incompatibilities in at least two levels of organization of the genetic material, the chromosomal and the genetic, expressed at the haploid gametophyte level. The integral evaluation of distinct variables associated with reproductive barriers allowed estimating the differential contribution of chromosomal homologies and genetic distance to the feasibility in obtaining viable and fertile hybrids between Arachis species. Overall, the information collected shows that none of the variables evaluated independently constitutes a good predictor of the crossability of the species and that it is essential to consider other variables, mainly those associated with prezygotic and early postzygotic isolation. It is proposed that the extension of these integrative analyses to the other species that comprise the secondary germplasm of peanut will be of relevance to optimize the criteria for the selection of parents for directed crosses and to promote the use of wild Arachis species in breeding programs.