Estandarización de un protocolo para obtención de inóculo inactivado de adenovirus aviar serotipos 4 y 8b en células LMH = Protocol standardization for obtaining inactivated inoculum of avian adenovirus serotypes 4 and 8b in LMH cells

Abstract

Adenovirus aviar tipo 1 (FAdV) es considerado un patógeno de importancia para la industria avícola. Los serotipos 4 (FAdV-4) y 8b (FAdV-8b) son responsables de hepatitis por cuerpos de inclusión (IBH) y síndrome de hidropericardio (HHS) en pollos y son prevalentes en el Perú. El objetivo del presente trabajo fue establecer un protocolo estandarizado de obtención de inóculos virales inactivados de FAdV-4 y FAdV-8b producidos en células de hepatoma de pollo (LMH). Para ello, células LMH al 70 % de confluencia,crecidas en medio DMEM con 10 % de suero fetal bovino, fueron infectadas con FAdV-4 o FAdV-8b para evaluar el valor de multiplicidad de infección (MOI) y tiempo de cosecha óptimos. Luego, se realizó la producción de 1L de ambos serotipos considerando un MOI de 10 y tiempo de cosecha de 96 h post-infección (hpi). Seguidamente, ambas cosechas virales fueron clarificadas y concentradas mediante ultrafiltración tangencial (UFT) en membrana de 100kDa e inactivadas con 30mM de etilenimina binaria (BEI) a 37°C por 18 h. La pérdida de infectividad fue corroborada por el cálculo de dosis infecciosa del 50 % de cultivo de células (TCID50). Nuestros resultados mostraron que con un MOI de 10 y cosecha de 96 hpi se alcanzó el mayor título viral (> 1x108 TCID50/mL). Además, se mostró que la UFT permitió concentrar 10 veces la cantidad de virus con una recuperación del 91% y que la inactivación con BEI fue eficiente. Los inóculos inactivados obtenidos pueden ser utilizados en la formulación de una vacuna para prevenir IBH y HHS en pollos de forma segura.

Avian adenovirus type 1 (FAdV) is considered an important pathogen for the poultry industry. Serotypes 4 (FAdV4) and 8b (FAdV-8b) are responsible for Inclusion Body Hepatitis (IBH) and Hydropericardium Syndrome (HHS) in chickens and are prevalent in Perú. The objective of this work was to establish a standardized protocol for obtaining inactivated viral inoculum of FAdV-4 and FAdV-8b produced in chicken hepatoma (LMH) cells. For this, LMH cells at 70 % confluence, grown in DMEM medium with 10 % fetal bovine serum, were infected with FAdV-4 or FAdV-8b to evaluate the optimal multiplicity of infection (MOI) value and harvest time. Then, the production of 1L of both serotypes was carried out considering an MOI of 10 and a harvest time of 96 h postinfection (hpi). Next, both viral harvests were clarified and concentrated by tangential ultrafiltration (UFT) on a 100kDa membrane and inactivated with 30mM Binary Ethyleneimine (BEI) at 37°C for 18 h. Loss of infectivity was corroborated by calculating the 50 % cell culture infectious dose (TCID50). Our results showed that with an MOI of 10 and a harvest time of 96 hpi, the highest viral titer was reached (> 1x108 TCID50/mL). In addition, it was shown that UFT allowed concentrating 10 times the amount of virus with a 91% recovery rate and that inactivation with BEI was efficient. The inactivated inoculum obtained can be used in the formulation of a vaccine to safely prevent IBH and HHS in chickens.