Estabelecimento de um modelo celular 3D utilizando-se co-culturas de células hepáticas para análises toxicológicas da atuação de fitossanitários no metabolismo pró-esteatótico

Abstract

Atualmente, as doenças hepáticas são consideradas um problema de saúde pública mundial e, entre elas, a esteatose se destaca. Caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura no fígado a esteatose se origina de diferentes etiologias tais como as causadas por transtornos alimentares, doenças autoimunes, causas virais e contato com substâncias nocivas, como os agrotóxicos e outros contaminantes ambientais. Nos dias atuais os agrotóxicos, nomeados como fitossanitários, são amplamente utilizados em vários países e tem o potencial de causar doenças metabólicas e sequelas hepatotóxicas. Considerando-se as disfunções metabólicas hepáticas, a esteatose hepática não alcoólica (DGHNA), ou simplesmente esteatose, pode progredir a quadros de fibrose e/ou hepatocarcinoma (HCC), cujos aspectos moleculares não se encontram completamente elucidados. Nesse contexto, a regulação do metabolismo lipídico é de suma importância para o controle e/ ou reversão do quadro de esteatose. Assim sendo, neste estudo foi estabelecido um modelo alternativo de baixo custo baseado em co-cultivo celular em ambiente 3D para a avaliação do metabolismo pró-esteatótico e dos efeitos toxicológicos de fitossanitários no estabelecimento da doença. Resultados obtidos com culturas 3D aproximamse mais dos encontrados em modelos in vivo, além disso a utilização de métodos alternativos ao uso de animais nas pesquisas vem ao encontro das necessidades das pesquisas contemporâneas. Para isso, células das linhagens de hepatócitos HepG2 (ATCC® HB-8065™) e de células estreladas hepáticas (CEH), LX-2, foram co-cultivadas e semeadas no modelo padronizado. Para a padronização do modelo de estudo e análises subsequentes, diferentes substratos que potencialmente viabilizam o crescimento celular em 3D foram testados isoladamente e/ou em combinação. A viabilidade das formações dos esferóides foi acompanhada por intervalos regulares de 24h, 48h e 72h, seguido de análises de azul de tripano. Análises de citotoxicidade MTT de diferentes fitossanitários foram avaliadas e as concentrações de estudo foram estabelecidas. Os resultados demonstraram que as co-culturas crescida em 0,5% de alginato + 0,75% de ágar por 48h formaram os melhores esferoides e apresentaram viabilidade superior a 70%. O substrato 3D apresentou viabilidade celular satisfatória quando incubadas com ácidos graxos (AGs) a 400 μM, por um intervalo de 24h de exposição. Com relação aos fitossanitários analisados, verificou-se que o inseticida fipronil (nas concentrações 2 μM e 20 μM) e o herbicida bromacil (nas concentrações de 5 nM e 50 nM) apresentaram melhores resultados de não citotoxicidade e integridade das células nas culturas 2D, portanto foram utilizadas na análise do modelo de estudo. A mensuração de TGs e glicose, após a exposição aos AGs e aos fitossanitários, demonstraram aumento estatisticamente significativo nos tratamentos, certificando a aplicabilidade do modelo 3D na avaliação do quadro pró-esteatótico.

Currently, liver diseases are considered a global public health problem and, among them, steatosis stands out. Characterized by excessive accumulation of fat in the liver, steatosis originates from different etiologies such as those caused by eating disorders, autoimmune diseases, viral causes and contact with harmful substances, such as pesticides and other environmental contaminants. Nowadays, pesticides, named as phytosanitary, are widely used in several countries and have the potential to cause metabolic diseases and hepatotoxic sequelae. Considering hepatic metabolic disorders, non-alcoholic hepatic steatosis (NAFLD), or simply steatosis, can progress to fibrosis and/or hepatocarcinoma (HCC), whose molecular aspects are not completely elucidated. In this context, the regulation of lipid metabolism is of the utmost importance for the control and/or reversal of steatosis. Therefore, in this study, an alternative low-cost model based on cell co-culture in a 3D environment was established for the evaluation of pro-steatotic metabolism and the toxicological effects of phytosanitary in the establishment of the disease. Results obtained with 3D cultures are closer to those found in in vivo models, in addition, the use of alternative methods to the use of animals in research meets the needs of contemporary research. For this, cells from the HepG2 (ATCC® HB-8065™) and hepatic stellate cell (HEC) LX-2 cell lines were co-cultured and seeded in the standardized model. For the standardization of the study model and subsequent analyses, different substrates that potentially enable 3D cell growth were tested alone and/or in combination. The viability of spheroid formations was monitored at regular intervals of 24h, 48h and 72h, followed by trypan blue analyses. MTT cytotoxicity analyses of different phytosanitary were evaluated and study concentrations were established. The results showed that co-cultures grown in 0.5% alginate + 0.75% agar for 48h formed the best spheroids and showed viability greater than 70%. The 3D substrate showed satisfactory cell viability when incubated with fatty acids (FAs) at 400 µM, for an interval of 24h of exposure. Regarding the phytosanitary analyzed, it was found that the insecticide fipronil (at concentrations of 2 µM and 20 µM) and the herbicide bromacil (at concentrations of 5 nM and 50 nM) presented better results of non-cytotoxicity and cell integrity in 2D cultures, therefore, they were used in the analysis of the study model. The measurement of TGs and glucose, after exposure to AGs and phytosanitary products, showed a statistically significant increase in the treatments, certifying the applicability of the 3D model in the evaluation of the pro-steatotic condition.