Biologia sintética aplicada no desenvolvimento de uma vacina recombinante para o controle da leishmaniose visceral canina

Abstract

A Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) é o agente etiológico da leishmaniose visceral, presente nas Américas, tendo os cães como seu principal reservatório do parasita, seguido de posterior ocorrência de casos humanos. Para controle da doença, novas soluções preventivas em cães, como a produção de novas vacinas, faz-se necessário. Um fragmento protéico de 206 aminoácidos de L. infantum denominada Lc24, que já teve sua antigenicidade anteriormente avaliada pelo nosso grupo de pesquisa, é alvo do presente estudo. Primeiramente foi feita a clonagem do fragmento correspondente a 624 pb no vetor pMAL-p5X para a obtenção de um produto protéico fusionado à proteína Maltose Binding Protein (MBP), seguido de confirmação por sequenciamento. Devido ao insucesso da expressão da proteína recombinante, utilizou-se como estratégia alternativa a síntese de peptídeos. Para isso, utilizouse uma estratégia de imuno-informática para seleção de epítopos contidos em sequências peptídicas pequenas, passíveis de serem sintetizadas, mas que guardassem as propriedades imunológicas de Lc24. A sequência protéica completa foi analisada utilizando os servidores BepiPred 2.0 e o ABCpred para reconhecimento de regiões de epítopos referentes a células B e, posteriormente, os servidores EpiDOCK, Rankpep, IEDB e NetMHCpan, para a predição de epítopos para os alelos H-2Kb, H-2Kd, H-2Db, H-2Dd e H-2Ld (para MHC-I) e IA-b, I-Ad e IE-d (para MHC-II), para reconhecimento por células efetoras do tipo T (CD4+ e CD8+ ). Os peptídeos selecionados também foram analisados in silico quanto a propriedades de antigenicidade, alergenicidade, toxicidade e similaridade frente a sequências de proteínas caninas e humanas. Dentre os diferentes peptídeos identificados, selecionou-se o peptídeo GD2102, tendo como base a metodologia de classificação de melhor peptídeo estudado neste trabalho para a síntese química. Importante destacar que foi adicionado uma valina na porção N-terminal para ajudar na estabilidade e solubilidade do peptídeo, e a sequência peptídica RS09, um conhecido adjuvante sintético. Adicionalmente, parte dos peptídeos também foram encapsulados em lipossomas para promover um processo mais lento de liberação. Embora não tenha sido detectado anticorpos IgG, IgG2 e IgG2a antígeno específicos em camundongos BALB/c e swiss imunizados com os peptídeos livres ou encapsulados (dias 0, 14 e 21 para a linhagem BALB/c e dias 0 e 14 para a linhagem swiss), novas análises são necessárias como a adição de uma aplicação de uma terceira imunização e/ou aumento na quantidade de peptídeos livres e encapsulados.

Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) is the etiologic agent of visceral leishmaniasis, present in the Americas, which has dogs as the main reservoir of the parasite, followed by the subsequent occurrence of human cases. To control the disease, new preventive solutions in dogs, such as the production of new vaccines, are necessary. A protein fragment of 206 amino acids from L. infantum called Lc24, which already had its antigenicity previously evaluated by our research group, is the subject of the present study. First, the fragment corresponding to 624 bp was cloned in the pMAL-p5X vector to obtain a protein product fused to the Maltose Binding Protein (MBP), followed by confirmation by sequencing. Given the failure of the recombinant protein expression, peptide synthesis was used as an alternative strategy. FFor this purpose, an immunoinformatics strategy was used to select epitopes contained in small peptide sequences that were capable of being synthesized but that retain the immunological properties of Lc24. The complete protein sequence was analyzed using the servers BepiPred 2.0 and ABCpred for the recognition of epitope regions referring to B cells. Later, the servers EpiDOCK, Rankpep, IEDB, and NetMHCpan, for the prediction of epitopes for the H-2Kb alleles, H-2Kd, H-2Db, H-2Dd, and H-2Ld (for MHC-I) and IA-b, I-Ad and IE-d (for MHC-II), for recognition by Ttype effector cells (CD4+ and CD8+ ). The selected peptides were also analyzed in silico for properties of antigenicity, allergenicity, toxicity, and similarity to canine and human protein sequences. Among the different peptides identified, the peptide GD2102 was selected based on the best peptide classification methodology studied in this work for chemical synthesis. It is important to highlight that a valine was added in the N-terminal portion to help with the stability and solubility of the peptide, and the peptide sequence RS09, a known synthetic adjuvant. Additionally, part of the peptides was also encapsulated in liposomes to promote a slower release process. Although antigen-specific IgG, IgG2, and IgG2a antibodies were not detected in BALB/c and swiss mice immunized with the free or encapsulated peptides (days 0, 14, and 21 for the BALB/c strain and days 0 and 14 for the swiss strain), new analyzes are necessary such as the addition of a third immunization and/or increase in the amount of free and encapsulated peptides.