Métodos de inoculação, avaliação da resistência e manejo de Ralstonia solanacearum em viveiro de produção de mudas

Abstract

O eucalipto, desde a sua introdução no Brasil, se estabeleceu como o principal cultivo de florestas plantadas em todo o território nacional, principalmente em função de programas de melhoramento genético que possibilitou a adaptação de várias espécies, híbridos, genótipos a diversas regiões do país e com menor tempo de corte. Entretanto, alguns problemas de ordem fitossanitária assolam as espécies e os materiais genéticos produzidos no Brasil e no mundo, com destaque para a murcha bacteriana ocasionada pela bactéria Ralstonia sp., bem como os danos econômicos gerados por ela. Entre o ano de 2016 e início de 2017, diversas amostras de eucalipto, oriundas de várias regiões do Brasil, foram enviadas à Clínica de Patologia Florestal da Faculdade de Ciências Agronômicas / UNESP-Botucatu, para diagnose de material vegetal com suspeita de infecção por essa bactéria. Destas amostras, 86,55% provenientes do estado de São Paulo, 62,50% de Minas Gerais, 58,33% do Mato Grosso do Sul, 60,36% da Bahia, 84,00% do Piauí e 30,23% do Maranhão, foram positivas para a infecção pelo patógeno, demonstrando a ampla disseminação desse microrganismo. Os objetivos deste trabalho foram: desenvolvimento de uma metodologia rápida para screening in vitro de genótipos de eucalipto quanto à resistência ao patógeno; analisar a morfologia de vasos xilemáticos e apresentar medidas de manejo preventivo para um viveiro florestal comercial. O isolado 924/19 foi caracterizado por análise morfológica e molecular e, posteriormente, testado a patogenicidade e virulência em plantas indicadoras. Três métodos foram testados para inoculação de explantes: 1- Método de imersão de haste; 2- Método de ferimento com inoculação por meio de palito com inóculo bacteriano e; 3- Método de injeção de haste. Realizou-se o screening in vitro de quatros genótipos de eucalipto inoculados com Ralstonia. Vasos de xilema de três genótipos de eucalipto com e sem infecção da bactéria foram analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Três metodologias para a desinfestação de Ralstonia na água de irrigação (ozonização, radiação ultravioleta e cloração da água) e uma para a assepsia de substrato (termoterapia) foram testadas. Em seguida verificou-se o efeito fitotóxico do cloro em mudas de eucalipto, irrigadas por diferentes concentrações de cloro ativo. Por fim, foi desenvolvido um sistema de assepsia da água do viveiro, chamado de Sistema de Cloração da Água de Irrigação (SCAI) e Câmara de Esterilização de Substrato (CES). Comprovou-se virulência e patogenicidade do isolado de Ralstonia 924/19. O método de inoculação por meio de injeção na base do caule foi o mais eficiente. O método rápido para screening in vitro é potencialmente funcional e pode ser empregado para avaliação em massa de genótipos de eucalipto em condição de micropropagação, por cultura de tecidos. Não houve diferença no diâmetro dos vasos de xilema de eucalipto de plantas com e sem a bactéria e a oclusão dos vasos por tilose foi dependente da concentração bacteriana na planta. Todos os ensaios apresentaram um ou mais tratamentos eficientes para eliminar a bactéria. A irrigação com água contendo 4 mg/L de cloro induziu fitotoxicidade em mudas de três genótipos de eucalipto. A implantação dos sistemas de assepsia foi eficaz em erradicar inóculos bacterianos de Ralstonia solanacearum da água de irrigação e substrato de um viveiro florestal comercial.

Eucalyptus, since its introduction in Brazil, has established itself as the main cultivation of planted forests throughout the national territory, mainly due to genetic improvement programs that allowed the adaptation of several species, hybrids, genotypes to different regions of the country and with shorter cutting time. However, some phytosanitary problems plague species and genetic materials produced in Brazil and worldwide, with emphasis on the bacterial wilt caused by the bacteria Ralstonia sp. and the economic damage generated by it. Between the year 2016 and the beginning of 2017, several samples of eucalyptus, from various regions of Brazil, were sent to the Forest Pathology Clinic of the Faculty of Agronomic Sciences / UNESP, for the diagnosis of plant material suspected of being infected with this bacterium. Of these samples, 86.55% from the state of São Paulo, 62.50% from Minas Gerais, 58.33% from Mato Grosso do Sul, 60.36% from Bahia, 84.00% from Piauí and 30.23% Maranhão, were positive, demonstrating the wide spread of the pathogen. The objectives of this work were: development of a rapid methodology for in vitro screening of eucalyptus genotypes for pathogen resistance; analyze the morphology of xylemic vessels and present preventive management measures for a commercial forest nursery. The 924/19 isolate was characterized by morphological and molecular analysis and subsequently tested for pathogenicity and virulence in indicator plants. Three methods were tested for inoculation of explants: 1- Stem immersion method; 2- Injury wound method with toothpick with bacterial inoculum and; 3- Rod injection method. In vitro screening was carried out on four eucalyptus genotypes inoculated with Ralstonia. Xylem vessels of three eucalyptus genotypes with and without bacterial infection were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM). Three methodologies for disinfesting Ralstonia in irrigation water (ozonation, ultraviolet radiation and chlorination of water) and one for substrate asepsis (thermotherapy) were tested. Then the phytotoxic effect of chlorine on eucalyptus seedlings, irrigated by different concentrations of active chlorine, was evaluated. Finally, a nursery water asepsis system called the Irrigation Water Chlorination System (SCAI) and Substrate Sterilization Chamber (CES) was developed. The virulence and pathogenicity of the Ralstonia 924/19 isolate was proven. The injection method at the base of the stem was the most efficient. The rapid method for in vitro screening is potentially functional and can be used for mass evaluation of eucalyptus genotypes in micropropagation condition, by tissue culture. There was no difference in the diameter of the eucalyptus xylem pots from plants with and without the bacteria, and the occlusion of the pots by tilose was dependent on the bacterial concentration in the plant. All trials had one or more efficient treatments to eliminate the bacteria. Irrigation with water containing 4 mg/L of chlorine induced phytotoxicity in seedlings of three eucalyptus genotypes. The implementation of asepsis systems was effective in eradicating inoculants of the Ralstonia solanacearum bacteria from the irrigation water and substrate of a commercial forest nursery.