Formulação de coquetéis de enzimas produzidas por fungos em cultivo sólido e aplicação na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar

Abstract

Esta tese aborda a produção de enzimas celulolíticas por cultivo sólido (CS) dos fungos termofílicos Myceliophthora thermophila I-1D3b e Thermoascus aurantiacus CBMAI756 e do mesofílico Trichoderma reesei QM9414 em substrato composto por bagaço de cana-deaçúcar (BC) e farelo de trigo (FT); a caracterização dos extratos obtidos quanto a temperatura e pH ótimos e a estabilidade; a formulação de coquetéis enzimáticos para aplicação na hidrólise de bagaço de cana não tratado (BNT), pré-tratado com ozônio, álcali e ultrassom (BOU) e com pré-tratamento hidrotérmico (BHT); e, por fim, as condições e a cinética da reação de sacarificação enzimática. O CS de M. thermophila levou à obtenção de extratos com as maiores atividades de endoglucanase (32 U/mL), β-glicosidase (3,5 U/mL) e FPA (0,7 U/mL). Os extratos apresentaram diferentes perfis de atividade e estabilidade em função de variações de pH e temperatura de reação e incubação, características desejáveis para aplicação na hidrólise de biomassa visando a produção de etanol de segunda geração (E2G). Após 24 h de hidrólise, maiores rendimentos em açúcares redutores totais (ART) foram atingidos empregando coquetel 1:1 v/v de extratos enzimáticos provenientes do CS de T. aurantiacus (TA) e T. reesei (TR) no BOU. Foi possível obter maior teor de ART (464 mg/g BOU vs. 396 mg/g BOU) com menor carga enzimática (9,9 FPA/g BOU com coquetel TA:TR 1:1 v/v vs. 12,6 FPA/g BOU com extrato de TA, respectivamente). Denota-se que há sinergismo entre as enzimas secretadas pelos dois fungos e que o uso de coquetéis é promissor, já que a liberação de ART aumentou 17 % com 78 % da carga enzimática. Para BNT, a maior liberação de ART foi 124 mg/g BC a 65 ºC, com carga enzimática 17,9 FPA/g BC. Nas hidrólises de BHT e BOU, foram liberados, respectivamente, 190 e 464 mg/g BC a 55 ºC, com carga enzimática 9,9 FPA/g BC, confirmando que o pré-tratamento aumenta a digestibilidade do BC e favorece a conversão de celulose, além de que a temperatura de hidrólise é relevante, sobretudo ao se empregar coquetel de enzimas produzidas por fungos distintos. Na cinética de hidrólise, observou-se que os teores de ART liberados aumentaram rapidamente no início da reação, tendendo a ficar constantes após 8 a 12 h, provavelmente em consequência de depleção da fração amorfa de celulose no substrato, adsorção improdutiva e gradual desativação das enzimas. Os parâmetros do ajuste do modelo hiperbólico à cinética de hidrólise são úteis para dimensionamento da etapa de sacarificação em busca de melhores rendimentos, a fim de tornar a produção de E2G atrativa e competitiva no mercado de biocombustíveis.

This thesis addresses the production of cellulolytic enzymes by solid cultivation (CS) of the thermophilic fungi Myceliophthora thermophila I-1D3b and Thermoascus aurantiacus CBMAI756 and of the mesophilic Trichoderma reesei QM9414 on a substrate composed of sugarcane bagasse (SCB) and wheat bran (WB); the characterization of the extracts obtained in terms of optimum temperature and pH and stability; the formulation of enzymatic cocktails for application in the hydrolysis of untreated SCB (BNT), pretreated with ozone, alkali and ultrasound (BOU) and with hydrothermal pretreatment (BHT); and, finally, the conditions and kinetics of the enzymatic saccharification reaction. The CS of M. thermophila provided extracts with the highest activities of endoglucanase (32 U/mL), β-glucosidase (3.5 U/mL) and FPA (0.7 U/mL). The extracts showed different profiles of activity and stability due to variations in pH and temperature of reaction and incubation, desirable characteristics for application in the hydrolysis of biomass aiming the production of second generation ethanol (E2G). After 24 h of hydrolysis, higher yields of total reducing sugars (TRS) were achieved using cocktail 1:1 v/v of enzymatic extracts from the CS of T. aurantiacus (TA) and T. reesei (TR) in BOU. It was possible to obtain a higher TRS content (464 mg/g BOU vs. 396 mg/g BOU) with lower enzyme load (9.9 FPA/g BOU with cocktail TA:TR 1:1 v/v vs. 12.6 FPA /g BOU with TA extract, respectively). It denotes there is synergism between the enzymes secreted by both fungi and the use of cocktails is promising, since TRS release increased by 17 % with 78 % of the enzyme load. For BNT, the highest TRS release was 124 mg/g BC at 65 ºC, with enzymatic load 17.9 FPA/g BC. In the hydrolysis of BHT and BOU, TRS released were 190 and 464 mg/g BC, respectively, at 55 ºC, with enzymatic load 9.9 FPA/g BC, confirming the pretreatment increases the SCB digestibility and favors the conversion of cellulose; additionally, hydrolysis temperature is relevant, especially when using a cocktail of enzymes produced by different fungi. In the hydrolysis kinetics, it was observed that the levels of ART released rapidly increased at the beginning of the reaction, tending to remain constant after 8 to 12 h, probably as a result of depletion of the amorphous fraction of cellulose in the substrate, unproductive adsorption and gradual deactivation of enzymes. The parameters of hyperbolic model fitted to the hydrolysis kinetics are useful for designing the saccharification stage aiming to better yields, in order to make E2G production attractive and competitive in the biofuels market.