Design de biomarcadores à base de sílica com complexos luminescentes de lantanídeos: avaliação citotóxica e imageamento celular

Abstract

A imagem de células por luminescência é uma ferramenta importante para a identificação e quantificação de muitas doenças. Os biomarcadores à base de lantanídeos se destacam sobre outros biomarcadores, pois apresentam excelentes propriedades luminescentes e longos tempos de vida de emissão. A presença de um carreador inerte acrescenta mais vantagens ao sistema, pois pode aumentar a solubilidade do luminóforo, aumentar a estabilidade em meio biológico e diminuir a toxicidade para permitir a visualização do meio biológico sem causar danos. Neste trabalho foi planejada a síntese botton-up de um material híbrido à base de sílica e de complexos de lantanídeos visando a aplicação como biomarcador que combina em um sistema único as propriedades luminescentes dos lantanídeos com as características de transporte das partículas. Desta forma, foram desenvolvidos e caracterizados híbridos luminescentes baseados em nanopartículas de sílica decoradas com complexos de Eu3+ e de Tb3+ que foram usados em testes exploratórios como biomarcadores na visualização de células e tecidos. Assim, partículas de sílica esféricas/esferoidais de 85 e 120 nm foram preparadas pelo método sol-gel e tiveram sua superfície funcionalizada covalentemente com ligantes Base de Schiff. Por RMN-Si29 observou-se a presença dos grupos Q4-2 e T3 confirmando a formação das partículas de sílica aminofuncionalizadas. Complexos de Eu3+ e de Tb3+ foram inseridos nas partículas por três metodologias: (i) passo a passo, (ii) inserção de complexo tris sobre a superfície funcionalizada e (iii) ancoragem de um complexo com função alcoxisilano. Por potencial zeta foi possível investigar a carga superficial das partículas após cada etapa de síntese, chegando a valores negativos para os híbridos finais, que exibiram luminescência vermelha para Eu3+ e verde para Tb3+. Após a adição do ligante -dicetonato para o Eu3+, verificou-se um aumento na eficiência quântica do estado emissor (5D0), bem como uma diminuição no número de moléculas de água de coordenação. Uma intensificação da emissão do Tb3+ também foi observada para este sistema após a adição do ligante ácido benzóico. A viabilidade celular das células CHO-k1 foi avaliada pelo método de MTT na presença dos híbridos, sendo observada viabilidades acima de 70 % até a concentração até 100 µg/mL. O processo de internalização das partículas pelas células foi investigado por MET, evidenciando um mecanismo de endocitose como provável processo. As imagens de microscopia confocal indicaram uma emissão vermelha dos biomarcadores de Eu3+ e verde para Tb3+, distribuídos pelo citoplasma, principalmente ao redor dos núcleos das células. Além das células vivas o sistema também foi testado com êxito para imageamento de tecido congelado de células de músculo gastrocnêmico de ratos. Portanto, as partículas de sílica decoradas com complexos de Eu3+ e Tb3+mostraram-se adequadas para atuarem como biomarcadores em ensaios biológicos, sendo a metodologia (i) a que apresentou os melhores resultados.

Cell imaging by luminescence is an important tool for the identification and quantification of several diseases. Biomarkers based on lanthanides stand out over other biomarkers because they have excellent luminescent properties and long emission lifetimes. The presence of an inert carrier adds further advantages to the system as it can increase the phosphor solubility, increasing the stability in the biological medium and decreasing the toxicity to allow visualization of the biological medium. In this sense, we planned a bottom-up synthesis of a silica-based hybrid material and lanthanide complexes that presents benefits for this type of application assembling in a single material the luminescent properties of lanthanides plus the transport characteristics of the particles. In this work, we developed and characterized luminescent hybrids based on silica nanoparticles decorated with Eu3+ and Tb3+ complexes that were used in exploratory tests as biomarkers in the visualization of cells and tissues. Thus, spherical/spheroidal silica particles of 85 and 120 nm were prepared by the sol-gel method and had their surfaces functionalized covalently with Schiff base ligands. By 29Si-NMR, the presence of Q4-2 and T3 groups was observed confirming the formation of aminofunctionalized silica particles. Eu3+ and Tb3+ complexes were inserted into the particles by three methodologies: (i) step-by-step, (ii) insertion of tris-complexes on the functionalized surface and (iii) anchoring of alkoxysilane functionalized complexes. By zeta potential it was possible to investigate the surface charge of the particles after each synthesis step, reaching negative values for the final hybrids, which showed red luminescence for Eu3+ and green for Tb3+. After addition of -diketonate ligand to Eu3+, there was an increase in the quantum efficiency of the emitter state (5D0), as well as a decrease in the number of coordinated water molecules. An intensification of the Tb3+ emission was also observed for this system after the addition of the benzoic acid ligand. The cell viability of CHO-k1 cells was evaluated by the MTT method in the presence of hybrids, with viability above 70%, up to the concentration of 100 μg/mL. The particles internalization process by the cells was investigated by MET, evidencing an endocytosis mechanism as a probable process. The confocal microscopy images indicated a red emission of the Eu3+ biomarkers and green for Tb3+, distributed mainly through the cytoplasm, and around the nuclei. In addition, the system has also been successfully tested for tissue imaging of gastrocnemius muscle cells from rats. Therefore, the silica particles decorated with Eu3+ and Tb3+ complexes were suitable to act as biomarkers in biological assays, and the methodology (i) presented the best results.