Comparação da produção de poli-hidroxibutirato por Cupriavidus necator parental e recombinante a partir de glicerol e glicose combinados

Abstract

Uma crescente demanda por produtos de base biológica está impulsionando o mercado mundial para a produção de bioplásticos. O poli-hidroxibutirato (PHB) é um biopolímero biodegradável e biocompatível com propriedades físicas próximas às do polipropileno. Um dos principais obstáculos para sua produção é o elevado custo e isso tem estimulado a procura por substratos de baixo custo, como o glicerol, subproduto do biodiesel. O consumo de glicerol pela bactéria Cupriavidus necator DSM 545 é lento, quando comparado a outros substratos como a glicose e ácidos orgânicos, por exemplo. A inserção de genes para o consumo de glicerol e a utilização de uma fonte de carbono adicional, como a glicose, pode aumentar os percentuais de acúmulo e a produtividade em biopolímero. O objetivo deste trabalho foi comparar a produção de PHB por C. necator DSM 545 (parental) e por C. necator_glpFK (que ancora os genes glpF e glpK de Escherichia coli para o consumo de glicerol), inicialmente a partir de glicerol e depois associando glicerol e glicose. Diferentes estratégias de cultivo foram realizadas: cultivos em agitador orbital e biorreator foram conduzidos para comparar o desempenho das cepas parental e recombinante. Cultivos em biorreator foram conduzidos afim de comparar a influência da concentração dos substratos glicose e glicerol no crescimento e produção de PHB pela cepa recombinante, e cultivo em modo batelada alimentada foi conduzido com finalidade de avaliar a influência do tipo de alimentação de glicerol sobre a produtividade em polímero. O cultivo para a produção de PHB por C. necator_glpFK também foi avaliado quanto a transferência e consumo de oxigênio, nas condições estudadas. O polímero produzido foi extraído e caracterizado. Os resultados mostraram que, em agitador orbital, as cepas foram capazes de produzir PHB com percentual de acúmulo de 44 e 57% para C. necator DSM 545 e para a recombinante, respectivamente. Foram realizados quatro cultivos em biorreator, que mostraram que C. necator_glpFK apresentou melhor desempenho em relação ao crescimento e produção de PHB do que a cepa parental. Os dados cinéticos dos cultivos em agitador orbital e biorreator mostraram que a cepa recombinante consumiu a totalidade dos substratos glicerol e glicose, com uma velocidade maior do que a cepa parental, proporcionando maior produtividade de biopolímero. Nos cultivos em batelada, realizados com a cepa recombinante e com concentrações de 20 g.L-1 de glicose e 10 g.L-1 de glicerol e no cultivo 20 g.L-1 de glicose e 25 g.L-1 de glicerol apresentaram produtividades de 0,41 g.L-1.h-1 e 0,30 g.L-1.h-1, com acúmulo de 73% e 74% de PHB, respectivamente. Os dados de transferência de oxigênio mostraram comportamento análogo, para os cultivos 20 g.L-1 de glicose e 10 de glicerol e 20 g.L-1 de glicose e 25 g.L-1 de glicerol, entre a velocidade de respiração microbiana (QO2X) e o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). Foi possível constatar que o uso do glicerol não afetou o polímero quanto às propriedades térmicas, e que o carbonato de propileno reutilizado pode ser empregado no processo de extração. Conclui-se que o cultivo em batelada 20 g.L-1 de glicose e 10 g.L-1 de glicerol, em glicerol combinado à glicose, apresenta melhor desempenho quanto à produtividade, entretanto o cultivo 20 g.L-1 de glicose e 25 g.L-1 de glicerol apresentou melhor percentual de acúmulo final de PHB entre as concentrações testadas. Assim, é possível afirmar que a associação dos substratos glicose e glicerol pode ser utilizada na produção de PHB com maior produtividade do que se usando apenas glicerol. O uso dos substratos em conjunto pode ser uma boa alternativa para diminuição de custos de produção de PHB, com uma boa produtividade.

Abstract : An increasing demand for bio-based products is boosting the global market for bioplastics production. Polyhydroxybutyrate (PHB) is a biodegradable and biocompatible biopolymer with physical properties close to those of polypropylene. One of the main obstacles to its production is the high cost and this has stimulated the search for substrates of low cost, like the glycerol, byproduct of the biodiesel. The consumption of glycerol by Cupriavidus necator DSM 545 is slow when compared to other substrates such as glucose and organic acids, for example. Insertion of genes for glycerol consumption and use of an additional carbon source, such as glucose, may increase percentages of accumulation and productivity in biopolymer. The objective of this work was to compare PHB production by C. necator DSM 545 (parental) and C. necator_glpFK (which anchors the glpF and glpK genes of Escherichia coli for the consumption of glycerol), initially from glycerol and then associating glycerol and glucose. Different cultivation strategies were performed: cultures in orbital shaker and bioreactor were conducted to compare the performance of the parental and recombinant strains. Bioreactor cultures were conducted in order to compare the influence of glucose and glycerol substrates concentration on growth and PHB production by the recombinant strain, and fed batch culture was conducted with the purpose of evaluating the influence of glycerol feed type on polymer productivity. The culture for the production of PHB by C. necator¬_glpFK was also evaluated as to oxygen transfer and consumption, under the studied conditions. The polymer produced was extracted and characterized. The results showed that, in an orbital shaker, the strains were able to produce PHB with a percentage of accumulation of 44 and 57% (w/w) for C. necator DSM 545 and for the recombinant, respectively. Four cultures were carried out in bioreactor, which showed that C. necator_glpFK presented better performance in relation to the growth and production of PHB than the parental strain. The kinetic data of the orbital and bioreactor cultures showed that the recombinant strain consumed all glycerol and glucose substrates at a faster rate than the parental strain, providing higher productivity of biopolymer. In the batch cultures, performed with the recombinant strain and with concentrations of 20 g.L-1 of glucose and 10 g.L-1 of glycerol and in the culture 20 g.L-1 of glucose and 25 g.L-1 of glycerol presented productivities of 0.41 g.L-1.h-1 and 0.30 g.L-1.h-1, with accumulation of 73% and 74% of PHB, respectively. The oxygen transfer data showed similar behavior for the cultures 20 g.L-1 of glucose and 10 g.L-1 of glycerol and 20 g.L-1 of glucose and 25 g.L-1 of glycerol between the microbial respiration rate (QO2X) and the coefficient volumetric oxygen transfer (KLa). It was possible to verify that the use of glycerol did not affect the polymer on the thermal properties, and that the reused propylene carbonate can be used in the extraction process. It is concluded that the batch cultivation of 20 g.L-1 of glucose and 10 g.L-1 of glycerol in glycerol combined with glucose presented a better yield performance, however, the culture 20 g.L-1 glucose and 25 g.L-1 glycerol showed a better percentage of final PHB accumulation between the concentrations tested. Thus, it is possible to affirm that the association of the substrates glucose and glycerol can be used in the production of PHB with greater productivity than if using only glycerol. The use of the substrates together can be a good alternative for lower production costs of PHB, with a good productivity.