| dc.description.abstract | Resumen
La fiebre aftosa es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta animales biungulados y que causa grandes pérdidas económicas. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (FMDV). El FMDV pertenece al género Aphthovirus, dentro de la familia Picornaviridae. La partícula viral, de estructura icosaédrica, está formada por una cápside proteica que alberga una molécula de RNA de simple cadena, de polaridad positiva, de alrededor de 8500 nucleótidos de longitud. El virus replica íntegramente en el citoplasma de una célula infectada.
Las vacunas actuales contra FMDV están basadas en virus inactivado químicamente y son muy efectivas para el control y la erradicación de la enfermedad, aunque presentan el riesgo de incorrecta inactivación o escape desde las plantas productoras. Además, requieren al menos 5 días para conferir protección. Por lo tanto, resulta de interés desarrollar estrategias antivirales complementarias a la vacunación, entre las que se ha propuesto la tecnología de interferencia de RNA (RNAi).
La RNAi es un proceso de silenciamiento génico postranscripcional en eucariotas, inducido por pequeñas moléculas de RNA complementarias al gen silenciado. Entre ellas se encuentran los microRNA (miR), que están codificados en el genoma celular, y los pequeños RNA derivados de moléculas exógenas como, por ejemplo, siRNA o RNA de horquilla corta (shRNA). Se ha postulado que el empleo de miR artificiales (amiR), es decir, miR diseñados racionalmente, constituye una herramienta segura y eficiente para el silenciamiento de un RNA de interés.
El objetivo general de esta tesis doctoral fue evaluar la potencialidad de controlar la replicación de FMDV mediante RNAi, bajo la hipótesis de que uno o más amiR complementarios al genoma viral constituyen herramientas eficaces para el silenciamiento del mismo. Para ello, se analizó en primer lugar la eficacia de shRNA y amiR dirigidos hacia tres
secuencias blanco ubicadas dentro la región 3D del genoma viral, codificante de la RNA polimerasa RNA dependiente de FMDV. Esta región del genoma viral se encuentra conservada entre los siete serotipos de FMDV. Mediante ensayos reporteros se demostró que tanto los shRNA como los amiR son efectivos cuando se expresan de manera individual. Sin embargo, la expresión en tándem de dos amiR distintos no mostró un efecto sinérgico sobre el silenciamiento del gen reportero.
Para evaluar el efecto de estos shRNA y amiR en el contexto de la replicación viral, los mismos se expresaron de manera transitoria en células BHK-21 y los cultivos se infectaron con FMDV A/Arg/01 a una alta multiplicidad de infección. A las 5 horas postinfección (hpi) se observó una inhibición del crecimiento de FMDV de entre 50 y 96% en células que expresan ambos tipos de mediadores de RNAi. Sin embargo, a las 24 hpi los títulos virales en estas células fueron similares a los alcanzados en células control. Los shRNA o amiR dirigidos hacia una misma secuencia blanco mostraron distinto grado de eficacia frente al FMDV.
Con el objetivo de disponer de una expresión estable de amiR en líneas celulares, y dado que se ha postulado que estos mediadores de RNAi producen menos toxicidad celular que los shRNA, se establecieron líneas celulares policlonales que expresan constitutivamente amiR individuales dirigidos hacia 3D. A su vez, 2 de estas líneas celulares se clonaron por dilución límite, obteniéndose 7 líneas celulares clonales que expresan 2 amiR de manera individual. La correcta expresión de los amiR maduros en cada línea celular se confirmó mediante la técnica de retrotranscripción (RT) seguida de stem loop-qPCR en tiempo real. Las líneas celulares establecidas se infectaron con FMDV A/Arg/01 y se evaluó la replicación viral a distintos tiempos postinfección. En algunos casos se demostró un efecto inhibitorio de los amiR sobre la replicación viral, que nuevamente resultó acotado temporalmente. Mediante secuenciación automatizada se descartó la selección de mutantes de escape al silenciamiento en las líneas celulares clonales infectadas. Estos resultados sugieren que los amiR diseñados, complementarios a las secuencias blanco dentro de la región 3D del genoma viral, son parcialmente efectivos para inhibir la replicación viral.
Con el objetivo de potenciar el silenciamiento de FMDV, se amplió la búsqueda de secuencias blanco de silenciamiento dentro del genoma completo de FMDV A/Arg/01. Para ello, se realizó una predicción bioinformática con los programas DSIR, i-Score, RNAxs y VIRrsiRNApred. Los resultados de estos programas se integraron mediante un algoritmo diseñado ad hoc a fin de obtener una única lista de secuencias blanco predichas ordenadas en función del puntaje relativo asignado por cada programa y de su frecuencia de aparición en los distintos programas. Mediante este abordaje se seleccionaron 5 secuencias blanco que presentaron un puntaje alto en al menos 4 de los programas utilizados. Dichas secuencias se ubican en las regiones PK, IRES, VP4, 2C y 3C del genoma viral.
Se construyeron vectores de expresión de amiR complementarios a las distintas secuencias blanco seleccionadas. La expresión de los distintos amiR maduros en células BHK-21 transfectadas se confirmó mediante RT-stem loop qPCR en tiempo real. A las 16 h postransfección, estas células se infectaron con FMDV A/Arg/01 y se analizó el efecto de la expresión de los amiR sobre la replicación viral. A las 5 hpi se observó una disminución del título viral en las células que expresan los amiRPK, amiRVP4, amiR2C y amiR3C respecto de células control. Para los amiRPK, amiRVP4 y amiR3C, esta disminución del título estuvo acompañada por una diferencia significativa en el número de moléculas de RNA viral en las células infectadas.
Se establecieron 5 líneas celulares policlonales que expresan de manera individual los amiR dirigidos contra las regiones PK, IRES, VP4, 2C y 3C. Estas líneas celulares se caracterizaron en cuanto a su capacidad antiviral mediante ensayos de formación de placas de lisis y curvas de crecimiento viral en múltiples pasos. En todas las líneas celulares evaluadas se evidenció una reducción significativa y transitoria de la replicación de FMDV mediada por los distintos amiR.
Con el fin de evaluar un potencial efecto sinérgico de la expresión simultánea de más de un amiR dirigido hacia las diferentes regiones del genoma viral, se construyeron plásmidos de expresión de dos o tres amiR en tándem y se evaluó el efecto antiviral de los mismos. La expresión transitoria de dos amiR dirigidos hacia las regiones VP4, 2C, 3C o IRES en diferentes
combinaciones produjo un efecto inhibitorio mayor que los amiR individuales, con tasas de inhibición mayores al 90%. Por el contrario, la expresión estable de 3 amiR en tándem dirigidos hacia las regiones 3C-2C-IRES, o VP4-2C-IRES, mostró un silenciamiento menor que el de los amiR individuales.
Los resultados obtenidos muestran que el abordaje bioinformático utilizado para la selección de secuencias blanco dentro del genoma de FMDV permitió diseñar amiR con adecuada actividad de silenciamiento. Asimismo, las regiones virales estudiadas (PK, IRES, VP4, 2C, 3C y 3D) resultaron accesibles en el contexto del genoma viral. Más aún, el efecto antiviral transitorio observado en las condiciones experimentales estudiadas, que coincide con lo documentado previamente por otros autores para otros serotipos de FMDV, sugiere la existencia de restricciones biológicas al silenciamiento, probablemente vinculadas con las modificaciones intracelulares que ocurren durante la infección por FMDV. | |
