| dc.description.abstract | Se investigó la optimización de la producción de dextrana vía proceso microbiológico, para lo cual se aisló una cepa de Leuconostoc mesenteroides seleccionada como potencial productora de dextrana. Para obtener y evaluar los parámetros de crecimiento, producción y síntesis, se realizaron tres fases por etapas, cada uno bajo condiciones definidas y controladas.
La primera fase experimental estuvo conformado por 3 series de 5 biorreactores rotulados. A cada frasco se le añadió 0,2 g; 0,35 g; 0,5 g; 1,0 g y 2,0 g de extracto de levadura; luego se le adicionó, por igual, 15 g de azúcar rubia (99.9% de sacarosa) y 1,0 ml de sales nutrientes. Se aforó a 100 ml con solución amortiguadora de fosfatos (Na2HPO4/NaH2PO4), diseñado a pH 7,5.
Se esterilizó a 121°C por 15 min, después se enfrió y se inoculó a cada uno 5,0ml de suspensión microbial (semillas) llevándose a incubar, primero a 28°C por 12 horas y luego a 25° para 12 horas más. Posteriormente, se extrajo la dextrana por precipitación añadiéndole 100 ml de alcohol etílico al 96%; se pesó el producto y se determinó que para 15 g de sacarosa/100 ml de solución y 0,5 g de extracto de levadura /100 ml de solución es posible sintetizar 3,175 g de dextrana/100 ml de solución equivalente al 28,2% de rendimiento y un pH final de 5,0.
La segunda fase estuvo conformada por 3 series de 24 biorreactores rotulados. A cada uno se le añadió 0,5 g de extracto de levadura y 15 g de azúcar rubia (99.9% de sacarosa); 1,0 ml de sales nutrientes y aforados a 100 ml con disolución Buffer de fosfatos a pH 7,5; enseguida, se llevó a esterilizar a 121 ºC por 15 minutos: Luego se retiró y enfrió a 25 ºC para sembrar a cada uno con 5,0 ml de inóculo (relación 1:20). Posteriormente, se llevó a incubar a 25°C por 24 horas.
Las extracciones se realizaron cada hora con alcohol etílico al 96% (en proporción 1:1) y se construyó con los datos una curva progreso; Determinándose que transcurridas unas 15 horas de biorreacción existía una máxima en la producción de 3,7 g de dextrana/100 ml de solución, con 33,1% de rendimiento y pH final de 5,4.
En la tercera fase se acondicionaron 3 series de 12 biorreactores rotulados. Al primero se añadió aproximadamente 5,0 g; al segundo 10,0 g; al tercero 15,0 g; al cuarto 20,0 g; al quinto 25,0 g; al sexto 30,0 g; al sétimo 35,0 g; al octavo 40,0 g; al noveno 50,0 g; al décimo 60,0 g; al onceavo 70,0 g y al doceavo 80,0 g; de chancaca triturada (al 86% de sacarosa) respectivamente.
Para que la biosíntesis enzimática se lleve a cabo, previamente, se purificó parcialmente las soluciones diluidas vía precipitación fraccionada con reactivo precipitante (NH4)2 HPO4; seguidamente, se ajustó a pH inicial de 7,5 con NH4OH 0,03 M y se calentó a 75ºC. Luego, se enfrió a 25 ºC, se centrifugó, se filtró y desechó el precipitado.
Al centrifugado se ajustó a pH 5,5 (máxima actividad enzimática) con HCl 0,01 M según el pH final del centrifugado; se esterilizó vía radiación UV (2.650 A) por una hora para evitar la inversión de los azúcares; luego, se añadió 5,0 ml de enzima cruda para posteriormente llevar a incubar a 25°C por 15 horas. Al final de esta etapa se extrajo la dextrana con alcohol etílico al 96%; se pesó el producto, se construyó la curva progreso y se determinó que para 21,5 g de sacarosa por 100 ml de solución (25 g de chancaca), es posible sintetizar 6,2 g de dextrana por 100 ml de solución, con un 28,8% de rendimiento y un pH final de 5,3.
Con el análisis cinético y las leyes de velocidad de Michaelis – Menten, se determinó la eficiencia y especificidad de acción de la enzima (dextransacarasa) frente al sustrato (sacarosa). La gráfica de la ecuación de Lineaweaver – Burk nos proporcionó el valor de la constante Km igual a 0,07 como una medida de la fuerza de atracción entre la enzima y el sustrato ES, el cual produjo una velocidad media de 3,8 x 10-3 µmol de dextrana/min.; es decir que, con 23,9 g de sacarosa (27,8 g de chancaca) la enzima produjo 6,82 g de dextrana/100 ml de solución (26.2% de eficiencia)
A mayores concentraciones de sacarosa, la velocidad de formación del producto alcanza un valor límite debido al fenómeno de saturación del enzima por el sustrato, al final del cual la velocidad máxima es de 8,0 x 10-3 µmol de dextrana/min. Es decir, con 47,8 g de sacarosa (55,6 g de chancaca) se produce 13,6 g de dextrana y con una eficiencia máxima de la enzima en el bioproceso de 28,4% respecto a la sacarosa (24,4% respecto a la chancaca) | |
