| dc.description.abstract | La mutagénesis es uno de los mecanismos esenciales involucrados en la generación de variabilidad genética y en la adquisición de fenotipos adaptativos en bacterias. En este sentido, frente a cambios ambientales repentinos o en la colonización de nuevos nichos ecológicos, un incremento en la tasa de mutación aumenta la probabilidad de adquirir aquellos fenotipos beneficiosos, constituyendo de esta manera una estrategia clave para la adaptación. Particularmente, las infecciones pulmonares crónicas causadas por Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (FQ) exhiben una alta prevalencia de cepas con una tasa de mutación espontánea incrementada, denominadas hipermutadoras, fundamentalmente asociada a la emergencia de mutantes deficientes en el sistema de reparación de bases apareadas incorrectamente (MRS). En este contexto, P. aeruginosa se desarrolla en las vías aéreas del pulmón FQ en un estilo de vida denominado biofilm, en donde las bacterias crecen adheridas a la mucosa respiratoria a través de una matríz de exopolisacáridos por ellas producida y exhiben características morfológicas y metabólicas diferentes a las expresadas durante el crecimiento planctónico. Este estilo de vida está asociado a un proceso de diversificación que implica la emergencia, selección y fijación de múltiples variantes fenotípicas a través de la adquisición de mutaciones beneficiosas. En contrapartida, durante la etapa de dispersión del biofilm, la cual consiste en el desprendimiento de las células desde el biofilm maduro, se produce una reversión de parte de estos rasgos adaptativos y las células vuelven a un estadío de vida planctónico, brindando la posibilidad de colonizar nuevos nichos y propagar la infección. Así, los procesos de formación y dispersión de biofilms suponen la emergencia y reversión de morfotipos específicamente adaptados. Debido a que ambos fenómenos estarían basados en mecanismos mutagénicos, un incremento en la tasa de mutación podría resultar beneficioso y favorecer el proceso completo. Dentro de este marco teórico, el objetivo principal de este estudio consistió en estudiar la flexibilidad de P. aeruginosa para diversificar y revertir en forma sucesiva a fenotipos característicos del crecimiento en biofilms y al mismo tiempo estudiar cuál es la implicancia de la hipermutabilidad en dicho proceso. Para ello, se utilizó como modelo al fenotipo de colonias pequeñas (SCV) de P. aeruginosa, uno de los morfotipos adaptados e hiperproductores de biofilms, el cual fue ensayado en cuanto a su emergencia y reversión en un ensayo de evolución in vitro experimental. Este ensayo fue realizado de manera repetida y sucesiva, analizando en paralelo líneas evolutivas independientemente fundadas a partir de un ancestro normomutador e hipermutador común. Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad en la conversión y reversión sucesiva al fenotipo SCV se encuentra favorecida ante un aumento en la tasa de mutación. En este sentido, el proceso de diversificación fenotípica así como el valor de frecuencia de reversión del fenotipo SCV fueron notablemente mayores en cepas hipermutadoras respecto a la cepa normomutadora, incluso cuando las propiedades fenotípicas de las SCV y sus respectivas variantes revertidas y ancestrales fueron similares. Mediante análisis de genómica estructural comparativa, se determinó que la base molecular que subyace al proceso de conversión/reversión SCV consiste en la regulación de los niveles intracelulares del segundo mensajero c-di-GMP, existiendo un marcado paralelismo evolutivo y una fuerte selección positiva, tanto en las líneas WT como en las hipermutadoras, para la mutagénesis de los sistemas de transducción wsp e yfi. En todos los casos, las mutaciones en estos sistemas se adquieren de un modo compensatorio, determinando el incremento y la disminución de los niveles de c-di-GMP en cada ciclo de conversión y reversión, respectivamente. Interesantemente, a medida que los ciclos evolutivos avanzan las líneas normomutadoras muestran a partir del ciclo 5 de evolución una fuerte restricción genética, evidenciada como una caída significativa en la frecuencia de conversión SCV. Esta restricción no fue observada para las líneas hipermutadoras, las cuales evolucionaron hasta el ciclo de evolución 16 inclusive. A partir del ciclo 5 de evolución, estas líneas muestran la adquisición de mutaciones en otras enzimas y reguladores involucrados en el metabolismo del c-di-GMP, las cuales no serían suficientes para adaptarse al esquema impuesto sosteniendo puramente un mecanismo de mutaciones compensatorias. La presencia de mutaciones de tipo inserción/deleción en secuencias repetidas pequeñas (SSR) de G:C en algunos genes implicados en la regulación de los niveles de este segundo mensajero, abren la posibilidad de que la mayor flexibilidad y adaptabilidad de las líneas hipermutadoras se base a su vez en un mecanismo de conversión y reversión de una misma mutación (“switch on/off mutations”), el que, a manera de un interruptor genético, permitiría la variación fenotípica de manera indefinida. El presente trabajo constituye un importante aporte para el conocimiento de la implicancia de la hipermutabilidad, por deficiencia en el MRS, en la adaptabilidad de P. aeruginosa, la cual subyace la notable versatilidad que esta especie bacteriana despliega para prosperar en un sin número de ambientes diferentes y, como patógeno oportunista, persistir en las vías aéreas de pacientes con FQ a lo largo de la vida del paciente sin poder ser erradicada por ninguna terapia hasta el momento conocida. | |
