Diseño y optimización de un proceso de producción de muteínas de interferón-alfa2b humano con mayor actividad biológica mediante glicosilación en células de mamífero

Abstract

En el presente trabajo de tesis se llevó a cabo la producción de IFN4N empleando células CHO-K1 y HEK293 como huéspedes y purificación. IFN4NCHO e IFN4NHEK fueron caracterizados en términos de su grado de glicosilación, farmacocinética y actividad biológica. El IFN4NCHO presentó una masa molecular aparente superior y N-glicanos altamente ramificados con un mayor contenido de ácido siálico respecto de la molécula obtenida a partir de HEK. Estudios de farmacocinética revelaron la existencia de diferencias significativas sólo en la etapa de absorción. Si bien ensayos de actividad biológica antiviral in vitro demostraron similitud entre ambas proteínas, la actividad antiproliferativa específica in vitro resultó dos veces superior para la variante obtenida en células HEK. El análisis de la actividad biológica antitumoral in vivo permitió confirmar estos resultados, demostrando la mayor potencia antitumoral del IFN4NHEK. Por otra parte se llevó a cabo la generación de nuevas muteínas hiperglicosiladas del hIFN-alfa2b, con el objetivo de optimizar la molécula IFN4N. El estudio de las nuevas moléculas permitió observar que el grado de glicosilación de las mismas se incrementó conforme aumentó el número de sitios potenciales para N-glicosilación, lo cual se tradujo en un incremento del tiempo de vida media plasmática. A su vez, las variantes carentes de la modificación R23N evidenciaron valores de ABE antiproliferativa in vitro superiores respecto del IFN4N. Los resultados de esta tesis revelan la importancia de encontrar el balance apropiado entre la actividad biológica in vitro y las propiedades farmacocinéticas para la obtención de un producto terapéutico innovador y efectivo.

In the present thesis work IFN4N was produced in CHO and HEK cells and purified. IFN4NCHO and IFN4NHEK were characterized in terms of glycosylation, pharmacokinetics and biological activity. IFN4NCHO exhibited a higher average molecular mass and more acidic and ramified isoforms compared to IFN4NHEK. Regarding pharmacokinetic studies, IFN4NHEK reached maximum plasma concentration 3-times faster than IFN4NCHO, however their elimination profile did not differ significantly. Also, despite the in vitro antiviral specific biological activity of both proteins was the same, IFN4NHEK was more efficient as an antiproliferative agent in different tumor-derived cell lines. Accordingly, IFN4NHEK showed a higher in vivo antitumor activity in animal models. As part of this thesis work new muteins of rhIFN-alpha2b were designed and constructed in order to improve the glycosylation degree and, consequently, the pharmacokinetic properties, and the in vitro antiproliferative activity of IFN4N. The characterization of the muteins showed that the introduction of new N glycosylation sites resulted in the increment of their glycosylation degree. The in vitro biological characterization showed that variants lacking the mutation R23N presented an increased antiproliferative activity. The results of this thesis demonstrate that searching for an appropriate balance between the in vitro biological activity and the pharmacokinetic properties in the context of an adequate production host would constitute the basis to generate an innovative and effective therapeutic product.