Identificação de novos tipos de splicing alternativo do gene TCIRG1 em diferentes tecidos humanos

Abstract

O objetivo do nosso trabalho foi a investigacao de novos tipos de splicing alternativo do gene TCIRG1 em tecidos humanos variados. Para tanto, houve necessidade de inicialmente elaborarmos um metodo de amplificacao especifica de variantes de splicing com delecao de uma parte. Metodos: Atraves de busca virtual na base de dados de EST selecionamos possiveis novas isoformas do TCIRG1. A expressao de formas de splicing do gene em 30 tecidos humanos foi estudada por RT-PCR. Para deteccao de variantes de splicing com delecao de uma parte, usamos PCR com primer abrangendo a juncao dos exons. Resultados: Em relacao a padronizacao do metodo de amplificacao com primer abrangendo a juncao dos exons: sugerimos definir o limite da especificidade da deteccao do transcrito alternativo considerando a quantidade do transcrito principal; demonstramos que a adicao de poucas moleculas do DNA competidor para o transcrito alternativo dramaticamente aumenta a especificidade da reacao e aplicamos esta estrategia para a deteccao especifica de um dos transcritos do TCIRG1. Em relacao a caraterizacao de variantes de splicing: descobrimos seis novos eventos de splicing alternativo do gene TCIRG1 e observamos sua ocorrencia na maioria dos 30 tecidos estudados; alem disso, observamos a ocorrencia, em varios tecidos de individuos normais, de dois dos tres eventos de splicing alternativo do gene TCIRG1 anteriormente encontrados somente em um paciente com osteopetrose maligna infantil. Demonstramos que diferentes eventos de splicing alternativo do TCIRG1 podem combinar-se e gerar multiplas variantes de transcritos. Conclusoes: Os nossos dados indicam que o splicing do TCIRG1 e extremamente complexo e pode estar submetido a regulacao dependente do tecido. A mudanca de leitura proteica, que acontece na maioria das variantes estudadas, provavelmente levaria a producao de moleculas mais curtas. Mais estudos sao necessarios para definir a expressao relativa e a distribuicao tecidual das multiplas variantes de transcrito do TCIRG1 geradas por combinacoes d varios eventos de splicing alternativo