Trabalho de conclusão de curso de graduação
O efeito sazonal do estresse térmico e do perfil endócrino no fluido folicular e no oócito bovino
Fecha
2022-07-21Autor
Gomes, Júlia Rius [UNIFESP]
Institución
Resumen
O estresse térmico no verão é um dos fatores que mais contribui para a queda da
fertilidade de vacas produtoras de leite. Estudos anteriores demonstram que o
estresse térmico afeta negativamente o crescimento folicular, a secreção hormonal,
a composição do líquido folicular, a função do endométrio e do oviduto, o fluxo
sanguíneo para o útero e a capacidade de desenvolvimento do oócito e do embrião.
No entanto, sabe-se que o folículo e o oócito estão entre os alvos principais dos
efeitos deletérios do estresse térmico. Dessa forma, este estudo visou determinar o
efeito do ambiente endócrino (fase folicular versus fase luteínica) e do estresse
térmico sazonal (meses quentes versus meses frios) no perfil redox oocitário e no
perfil bioquímico do oócito e do fluido folicular. O índice de temperatura e umidade
(ITU), calculado com base na temperatura do bulbo seco e umidade relativa, foi
utilizado como indicador de conforto animal para agrupar os meses em quentes
(ITU> 72) e frios (ITU< 72). Para tanto, ovários de abatedouro foram selecionados
de acordo com a presença (CL+) ou ausência (CL-) do corpo lúteo (CL) nos meses
quentes e frios do ano. Foram utilizados 15 ovários por grupo (CL+ e CL-) em cada
réplica. O fluido folicular (FF) e os oócitos foram coletados por aspiração dos
folículos ovarianos de 2-8 mm de diâmetro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs)
coletados foram desnudados por pipetagens repetidas. Os oócitos desnudos e o FF
foi armazenado a - 80oC. Na primeira parte do experimento a quantificação das
espécies reativas de oxigênio foi realizada em meses quentes (janeiro de 2022) e
meses frios (agosto, setembro, novembro e dezembro de 2021). Para tanto, os
oócitos desnudos foram incubados em 5 μM de CellROXTM Green por 30 min e
avaliados em microscópio de epifluorescência Zeiss Axio Imager A2 (n=6 réplicas).
Na segunda parte do experimento, a microscopia confocal Raman foi utilizada para
determinação do perfil bioquímico das amostras em meses quentes (fevereiro e
março de 2021 e janeiro e fevereiro de 2022) e meses frios (abril a dezembro de
2021) ao longo de 1 ano. Os oócitos coletados foram fixados em paraformaldeído
4%, lavados em PBS, utilizando de 3 a 5 oócitos por grupo; para FF foi coletado 5 uL
de amostra de cada grupo para análise. Foram feitas 24 réplicas para ambos os
grupos de oócitos e FF. O experimento apontou uma diferença significativa (P<
0,0001) na síntese de ROS em oócitos entre os meses frios e quentes, sem
interferência do ambiente endócrino. O perfil bioquímico de fluido folicular e de
oócitos apresentou resultados qualitativos sobre a atribuição dos picos relatados nos
espectros vibracionais do Raman, sendo observado componentes estruturais típicos
da composição de oócitos e fluido folicular, como bases nitrogenadas, cadeias de
carbono, amidas e picos mais específicos como triptofano (749-760 cm -1),
fenilalanina (1000 - 1030 cm-1) e carotenóides (1520 - 1538 cm-1). Os estudos sobre
os efeitos do ambiente endócrino e do estresse térmico sobre o perfil bioquímico de
oócitos e fluido folicular bovino precisam ser investigados com mais aprofundamento
a fim de observar os efeitos dos diferentes tratamentos térmicos in vivo. The thermic stress in summer is one of the elements that contributes to the fertility fall on milk producing cows. Previous studies show how the thermic stress affects originally the follicular growth, the hormonal secretion, the follicular liquid composite, the endometrium and oviduct function, the blood flow to the uterus and the development capacity of the oocyte and the embryo. Even though, it’s known that the follicular and the oocyte are among the main targets of the deleterious effects of the thermic stress. This way, this study aimed to determinate the endocrine environment effect (follicular stage versus luteal stage) and the seasonal thermic stress (warm months versus cold months) on the redox oocyte profile and on the oocyte biochemical and follicular fluid profile. As such, the slaughtered ovaries were selected according to the presence (CL+) or absence (CL-) in the luteal body in the warm and cold months of the year. There were used 15 ovaries by group (CL+ and CL-) in each replica. The follicular fluid (FF) and the oocytes were gathered by the ovarian follicles vacuuming of 2-8mm diameter. The oocyte-cumulus complex (CCOs) were collect from the FF sedimentation, undressed by repeated pipetting and traced on Petri dish and the FF was stored in -80°C. In the first part of the experiment, the oxygen reactive species quantification was watched in warm months (January 2022) and cold months (August, September, November and December 2021). For that, the naked oocytes were incubated in 5 μM of CellROXTM Green for 30 min and evaluated in a Zeiss Axio Imager A2 epifluorescence microscope (n=6 replicates). Oh the second part of the experiment, the Raman confocal microscopy was used to determine the biochemical profile of the samples in warm months (February to March 2021 and January and February 2022) and cold months (April to December 2021) across 1 year. Fixed oocytes in 4% paraformaldehyde were washed in PBS, using 3 to 4 oocytes by group; for FF was collected 5 uL samples of each group for analyses. There were made 24 replicas for both groups of oocytes and FF. The experiment showed a significant difference (P< 0.0001) in the synthesis of ROS in oocytes between the cold and warm months, without interference from the endocrine environment. The biochemical profile of follicular fluid and oocytes showed qualitative results on the attribution of reported peaks in Raman vibrational spectra, typical structural components of the composition of oocytes and follicular fluid were observed, such as nitrogenous bases, carbon chains, amides and more specific peaks such as tryptophan (749-760 cm -1), phenylalanine (1000 - 1030 cm-1) and carotenoids (1520 - 1538 cm-1). Studies on the effects of the endocrine environment and heat stress on the biochemical profile of oocytes and bovine follicular fluid need to be further investigated in order to observe the effects of different heat treatments in vivo.