Estudo da atividade carboxipeptidasica da catepsina B utilizando bibliotecas combinatorias de peptideos com supressao intramolecular de fluorescencia

Abstract

Usamos bibliotecas combinatorias de peptideos com supressao intramolecular de fluorescencia para estudar a atividade carboxidipeptidasica da catepsina B. Mapeamos a especificidade dos subsitios S3, S2, S1 e S'1. Para definir a especificidade do subsitio S1 foi sintetizada uma primeira biblioteca com estrutura geral Abz-GXXZXK(Dnp)-OH (Abz=acido orto-amino benzoico; Dnp=2,4-dinitofenil; Z=aminoacido natural fixado na posicao, X=mistura de aminoacidos naturais incorporados randomicamente). Os resultados mostraram que este subsitio tem ampla especificidade podendo acomodar aminoacidos de diferentes classes como Arg, Phe, Leu, Ser, Gly. A especificidade dos subsitios S'1, S2 e S3 foi ensaiada com Abz-GXXRZK(Dnp)-OH, Abz-GXZRXK(Dnp)-OH e Abz-GZXRXK(Dnp)-OH, respectivamente. Nestas sub-bibliotecas, um residuo de Arg foi fixado na posicao P1 por ser o aminoacido mais susceptivel a hidrolise e para facilitar a solubilizacao dos peptideos. Os resultados mostraram que o subsitio Sz da catepsina B tem preferencia por peptideos contendo Val e Phe em P2. Em relacao ao subsitio S3 ficou demonstrada uma clara preferencia por lle, sendo Lys e Phe tambem bem aceitos. O subsitio S'1 apresentou especificidade menos definida acomodando diferentes classes de aminoacidos. Com base nos resultados das bibliotecas sintetizamos o peptideo Abz-GIVRAK(Dnp)-OH que contem os residuos mais favoraveis nas posicoes P3, P2, P1 e P'1. Este peptideo foi hidrolisado pela catepsina B com alta efiCiência catalitica (kcat/Km= 7288 mM-1 s-1). A ligacao clivada foi Arg-Ala como demonstrado por HPLC e pela espectroscopia de massa. Alem disso, Abz-GIVRAK(Dnp)-OH mostrou ser um substrato altamente seletivo para a catepsina B sendo praticamente resistente a hidrolise por outras cisteino-peptidases lisossomais como as catepsinas L, V e K