Reprogramacao de celulas-tronco mesenquimais de tecido adiposo para formacao e enriquecimento de cardiomiocitos

Abstract

A producao em larga escala de cardiomiocitos e um passo fundamental na terapia celular e engenharia tecidual para tratar doencas cardiovasculares, principalmente as causadas pela isquemia. Em vista disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer um procedimento eficiente para producao de cardiomiocitos atraves de reprogramacao de celulas-tronco mesenquimais de tecido adiposo. Inicialmente foram construidos vetores lentivirais contendo promotores de genes expressos especificamente em cardiomiocitos, ATP2a2, GJA1, MYH6, MYL2 e NPPA, dirigindo a expressao bicistronica dos genes neoR e GFP, a fim de permitir tanto o acompanhamento da reprogramacao em cardiomiocito quanto a selecao destas celulas para sua amplificacao e caracterizacao. A reprogramacao foi realizada com 5Æ-azacitidina, seguida por eletroporacao com o plasmideo pOKS2a, que expressa os genes Oct4, Klf4 e Sox2. Observou-se que a expressao de GFP iniciou-se com a transfeccao do pOKS2a e persistiu, na maioria dos casos, durante alguns dias. A quantificacao de celulas GFP+ ao longo da reprogramacao indica que menos de 0,015 % das celulas estavam ativadas, geralmente, nos primeiros dias apos a transfeccao. As celulas GFP+ foram selecionadas com G418 para buscar marcadores moleculares de cardiomiocitos atraves de RT-PCR e imunocitoquimica. Tanto os marcadores genicos como os marcadores proteicos caracteristicos de cardiomiocitos estavam presentes nas celulas selecionadas, com algumas variacoes entre elas. O conjunto destes resultados indica que as celulas reprogramadas tinham caracteristicas de um cardiomiocito, no entanto, a variacao morfologica e de marcadores moleculares indicam que ha necessidade de caracterizacoes adicionais para valida-las como cardiomiocito