Análise da expressão do gene kiaa1549-braf e das mutações dos genes idh1 e idh2 em amostras de astrocitomas de baixo grau da infância

Abstract

Low-grade astrocytomas comprise about 30% of the central nervous system tumors in children. Several investigations have looked for the correlation between the KIAA1549-BRAF gene fusions and mutations at IDH1 and IDH2 genes in low grade pediatric astrocytomas. This study analyzed the expression of the fusion gene KIAA1549-BRAF and mutations at exon 4 of the IDH1 and IDH2 genes in samples of PA and A-II pediatric patients. The correlation between these alterations and the clinical profile of the patients were also evaluated. Eighty-four samples of low grade astrocytomas (63 pylocitic astrocytomas – PA – and 21 grade II astrocytomas – A-II) were analyzed by PCR for each of the targets and sequenced to identify specific mutations in the IDH genes. In 47% of the samples we identified the KIAA1549-BRAF fusion transcript. Mutations in the R132/R172 residues of the IDH1/IDH2 genes were detected in only two samples and the G105G polymorphism (rs11554137:C>T) was identified in 10 patients. Additionally, we observed two mutations out of the usual hotspots at IDH1 and IDH2 genes. The survival analysis of the patients considered as clinically relevant demonstrated that those with the KIAA1549-BRAF fusions had a 5-year overall survival of 90% compared with 30% for those who did not have the fusion transcript. We observed a smaller frequency of mutations in IDHs genes than previously described, but since these studies are composed of adult or mixed (adults and children) samples, we believe that our results represent a relevant contribution to the growing knowledge in low grade childhood astrocytomas.

Os astrocitomas correspondem a 70% dos tumores do sistema nervoso central (SNC). Os gliomas de baixo grau I e II compreendem a maioria dos tumores de SNC em crianças, enquanto que os de alto grau, principalmente o glioblastoma multiforme (grau IV), predominam em adultos. Pouco é conhecido a respeito das características moleculares dos gliomas de baixo grau da infância. As alterações genéticas frequentemente observadas nos tumores de pacientes adultos como; mutações do gene TP53 e/ou do gene PTEN, deleção bi alélica do gene CDKN2A, a amplificação do gene CDK4 ou do gene EGFR e perdas do cromossomo 10 são raramente encontradas nos astrocitomas da infância. Estudos demonstram que o gene de fusão KIAA1549-BRAF é um evento frequente em astrocitomas pilociticos (grau I), podendo variar de 41-93% nos gliomas de baixo grau dos pacientes pediátricos, porém esse gene de fusão foi raramente encontrado em astrocitomas difusos. Além disso, estudos recentes têm apresentados que mutações nos genes IDH1 e IDH2 estão relacionadas na patogênese dos gliomas malignos. Objetivos: Investigar a presença do gene de fusão KIAA1549-BRAF e das mutações dos genes IDH1 e IDH2 em fragmentos tumorais de astrocitomas de baixo grau da infância e correlacionar os achados moleculares com os aspectos clínico-patológicos dos pacientes. Materiais e Métodos: Para realização do estudo foram utilizadas 84 amostras de fragmentos tumorais, sendo 63 de astrocitomas de grau I e 21 de astrocitomas de grau II. As amostras foram submetidas à extração do RNA por meio do reagente Trizol® (Invitrogen) e à extração de DNA por meio do kit Nucleospin® Triprep (Macherey-Nagel). A síntese de cDNA foi feita a partir de 1 µg de RNA, segundo protocolo SuperScript III RT–First Strand for RT-PCR da (Invitrogen®). A investigação da presença do gene de fusão KIAA1549-BRAF foi realizada através de RT-PCR, segundo protocolo descrito previamente (Forshew et al, 2010). O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno. Para a investigação das mutações dos genes IDH1 e IDH2 foi realizado o sequenciamento do éxon 4 de ambos os genes, após a amplificação desta região por RT-PCR. Resultados: Nós detectamos o gene de fusão KIAA1549-BRAF em 39% das amostras de astrocitoma testadas. Dessas amostras 82% eram de A-I e 18% de A-II, porém não houve correlação com nenhum dos parâmetros clínicos avaliados nem com a sobrevida. Nós detectamos 12 amostras que apresentaram alterações em IDH: 2 amostras apresentaram mutação em IDH1, uma em R132 e a outra fora dos hotspos de mutação. Ainda em IDH1 foram encontradas 10 amostras com polimorfismo G105G. A análise das mutações em IDH2 apresentou uma amostra mutada em R172 e uma mutação fora dos hotspots.