Mutação em NOX3 estimula a proliferação de progenitores neurais cerebelares pela ativação da via de SHH

Abstract

TThe cerebellum is a region of the central nervous system is responsible for motor coordination and balance. In the embryonic period, the most populous cerebellar neuron, the granular cells, proliferate by Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway. The SHH signaling pathway is activated by the SHH mitogen, secreted by Purkinje cells (PC), and stimulates the proliferation of granular cell precursors (GCP) until the postnatal period. The PC is the main efferent neuron of the cerebellum and the correct location of PC in the cerebellum is crucial for the correct execution of motor functions. Cerebellar neural stem cells (NSC) located in the white matter participate in the formation of neoplasias. The exacerbated proliferation of NSC forms the medulloblastoma, a tumor located in the cerebellum that affects mainly children. The mice lineage called Nox3eqlb was selected in an ENU mutagenesis project because it presented a phenotype of lack of motor coordination and balance. Nox3eqlb presents an A> T transversion in the Nox3 gene of mouse chromosome 17. This mutation caused an amino acid substitution of Asparagine for Tyrosine at position 64 of the protein. In addition, Nox3eqlb exhibits a disorganization in the PC layer (PCL) and an exacerbated proliferation of PCG. NOX3 is a member of the NADPH oxidase family that produces reactive oxygen species (ROS) by reducing oxygen. ROS produced by NOX participate in the modulation of various cellular signaling pathways in various cellular processes, including proliferation. Therefore, the objective of this project was to study the participation of ERO produced by NOX in the control of the proliferation of PCG and cerebellar NSC by the signaling pathway activated by SHH in the Nox3eqlb mice. The Nox3eqlb mice showed increased proliferation of cerebellar NSC and high amounts of H2O2 in vitro GCP and NSC after 7 days. After 12 days, Nox3eqlb exhibits reduced amounts of H2O2 in vitro GCP and NSC compared to wild BALB/c. In addition, Nox3eqlb shows a higher amount of pathway activating mitogen, SHH, and increased expression in SHH pathway members, including Gli1, 2, 3 and Cyclin D1. Nox3eqlb presents increased and decreased expression in genes related to the cell cycle and that promote cell propagation. After inhibition of NOX by apocynin, PCG and NSC showed reduction of proliferation in vitro, and PCG showed reduction of proliferation in vivo. After treatment with apocynin, members of the SHH pathway presented altered expression and after treatment from the embryonic to postnatal period with Apocynin, Nox3eqlb showed improvement in motor function and decreased PCL disorganization.

O cerebelo é uma região do sistema nervoso central responsável pela coordenação motora e equilíbrio. No período embrionário, o mais populoso neurônio do cerebelo, as células granulares, proliferam pela via de sinalização Sonic Hedgehog (SHH). A via de sinalização SHH é ativada pelo mitógeno SHH, secretado pelas células de Purkinje (CP), e estimula a proliferação dos precusores de células granulares (PCG) até o período pósnatal. As CP é o principal neurônio eferente do cerebelo e a correta localização da CP no cerebelo é crucial para a correta execução das funções motoras. As células-tronco neurais (CTN) cerebelares localizadas na substância branca participam da formação de neoplasias. A proliferação exacerbada das CTN forma o meduloblastoma, um tumor localizado no cerebelo que acomete principalmente crianças. Uma linhagem de camundongo chamada Nox3eqlb foi selecionada em um projeto de mutagênese por ENU por apresentar um fenótipo de falta de coordenação motora e equilíbrio. O Nox3eqlb possui uma transversão de A>T no gene Nox3 do cromossomo 17 do camundongo. Essa mutação, ocasionou uma substituição de aminoácido de Asparagina para Tirosina na posição 64 da proteína. Além disso, o Nox3eqlb apresenta uma desorganização na camada de CP e uma proliferação exacerbada dos PCG. Nox3 é um membro da família da NADPH oxidase que produz espécies reativas de oxigênio (ERO) pela redução do oxigênio. As ERO produzidas por NOX participam da modulação de diversas vias de sinalização celular em diversos processos celulares, incluindo proliferação. Mediante a isso, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação de ERO produzidas por NOX no controle da proliferação de PCG e CTN cerebelares pela via de sinalização ativada por SHH no camundongo Nox3eqlb. O camundongo Nox3eqlb apresenta aumento de proliferação das CTN cerebelares e altas quantidades de H2O2 em PCG e CTN in vitro após 7 dias. Após 12 dias, o Nox3eqlb apresenta quantidades reduzidas de H2O2 em PCG e CTN in vitro em comparação com o selvagem BALB/c. Além disso, o Nox3eqlb apresenta uma quantidade superior do mitógeno ativador da via, SHH, e aumento de expressão nos membros da via de SHH, incluindo Gli1, 2, 3 e Ciclina D1. O Nox3eqlb apresenta aumento e redução de expressão em genes relacionados ao ciclo celular e que promovem a propagação celular. Após a inibição de NOX por apocinina, os PCG e CTN apresentaram redução da proliferação in vitro, e os PCG apresentaram redução da proliferação in vivo. Após o tratamento com apocinina, os membros da via de SHH apresentaram alteração de expressão e após o tratamento desde o período embrionário até pós-natal com apocinina, o Nox3eqlb apresentou melhora na função motora e diminuição da desorganização da CCP.