Estudo da modulação da atividade proteolítica no plasmodium e em tecidos de camundongos infectados

Abstract

Malaria is a major public health problem, the parasitic infection with the highest incidence in the world. The parasite that causes this disease belongs to the genus Plasmodium. In 2012 were recorded about 207 million cases in subtropical and tropical areas of the world and it results in more than 600,000 deaths per year. It is well known that proteolytic enzymes of Plasmodium are fundamental in the development and survival of the parasite in the host. Many Plasmodium cellular events are regulated by calcium and protein phosphorylation. Both signaling mechanisms are important modulators of protease activity, in particular the cysteine proteases (calpains) study, wich activity is calcium dependent. In P. falciparum, this protease presents a single copy in the genome, being a potential target of inhibition. Proteolysis of isolated parasites (P. falciparum) was assessed using fluorogenic substrates in spectrofluorimeter. The results showed a predominance of cysteine proteases activity in parasite’s cytoplasm. The intracellular calcium increase from organelle (ER) and from the extracellular medium (opening from membrane channels) changed significantly the proteolysis of Z-Phe-Arg-AMC substrate and was greatly inhibited by ALLN (selective calpain inhibitor). Intracellular calcium concentration measured with Fluo-4 AM calcium indicator was in the range 1-2µM, which indicates it is a µ-calpain responsible for proteolytic activity in Plasmodium. The dependence of calpain for intraerythrocytic development was evaluated by using the ALLN in P. falciparum culture, wich resulted in significant reduction of infected erythrocytes. The role of cAMP and kinases in intracellular proteolytic activity of cysteine proteases were not observed by the addition of cAMP analogs (8Br-cAMP/N6-cAMP) or kinases inhibitors/activators (PKA and PKC). However, we cannot reject the involvement of these elements in proteolytic activity modulation in different stages of parasite cycle. In infected mice with P. chabaudi, we checked the activity of MMPs, ACE and ACE2 in different tissues, compared with normal mice. In tissues in which there were differences in activity, normal tissues showed higher metalloproteases activity, suggesting the involvement of endogenous tissue inhibitors in infected tissues. Kinins are vasoactive peptides generated from proteolytic cleavage of its precursors, kininogens, which are synthesized by the liver. Bradykinin (BK), Lys-BK and kallidin act in the constitutive B2 receptor, whereas des-Arg9-BK, Lys-des-Arg9-BK and des-arg10 - kallidin acts in induced B1 receptor. Immunofluorescence assays showed more intense staining of the B2 receptor in infected livers, compared to normal mice livers. Based on these results, this thesis contributes to clarify the parasite cytoplasmic proteolytic activity in P. falciparum indicating new potential targets for antimalarial drugs, and changes in liver, kidneys and lungs physiology involving kinin signaling during infection by Plasmodium chabaudi, enabling to understand malaria pathophysiology

A malária é um dos principais problemas de saúde pública, a infecção parasitária com maior incidência no mundo. O parasita causador desta doença pertence ao gênero Plasmodium. Em 2012 foram registrados cerca de 207 milhões de casos nas áreas subtropicais e tropicais do planeta e resulta em mais de 600 mil mortes por ano. Sabe-se que as enzimas proteolíticas do Plasmodium são fundamentais no desenvolvimento e sobrevivência do parasita no hospedeiro. Muitos eventos celulares do Plasmodium são regulados pelo cálcio e fosforilação de proteínas. Ambos mecanismos de sinalização celular são importantes moduladores da atividade proteolítica, em particular no estudo de cisteíno-proteases (calpaínas) que são dependentes de cálcio. No P. falciparum, esta protease apresenta-se em cópia unica no genoma, sendo um potencial alvo de inibição. A proteólise de parasitas isolados (P. falciparum) foi analisada através do uso de substratos fluorogênicos no espectrofluorímetro. Os resultados demonstraram a predominância da atividade de cisteíno-proteases no citoplasma do parasita. O aumento de cálcio intracelular a partir do retículo endoplasmático e do meio extracelular (abertura de canais de membrana), alterou significantemente a atividade proteolítica com o substrato Z-Phe-Arg-MCA que foi inibida pelo ALLN (inibidor seletivo de calpaína). A concentração de cálcio intracelular obtida com indicador de cálcio (Fluo-4 AM) foi na faixa 1-2µM, o que indica se tratar de uma µ-calpaina responsável pela atividade proteolítica no Plasmodium. A dependência da calpaina no desenvolvimento intraeritrocítico foi avaliada com a adição do inibidor ALLN na cultura de P. falciparum, o que resultou na redução significativa dos eritrócitos infectados. O papel da sinalização por AMPc e das proteínas quinases na atividade proteolítica intracelular de cisteíno-proteases também foram avaliados, e foram utilizados os análogos de AMPc (8Br-AMPc e N6-AMPc) e inibidores/ativadores de quinases (PKA e PKC). Apesar de não ter observado mudanças significativas, não podemos descartar o envolvimento desses elementos na modulação da atividade proteolítica em diferentes etapas do ciclo do parasita. Em camundongos infectados com P. chabaudi, verificamos a atividade de MMP’s, ECA e ECA2 em diferentes tecidos (Rim, fígado e pulmão), comparados com camundongos normais. Nos tecidos nas quais houveram diferença de atividade, os tecidos normais apresentaram maior atividade das metaloproteases, sugerindo o envolvimento de inibidores teciduais endógenos em tecidos infectados. As cininas são peptídeos vasoativos gerados a partir de clivagem proteolítica de seus precursores, os cininogênios, que são sintetizados pelo fígado. Bradicinina (BK), Lys-BK e calidina atuam no receptor constitutivo B2, enquanto desArg 9 -BK, Lys-des-Arg 9 -BK e des-Arg 10 -calidina atuam no receptor induzido B1. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a maior expressão do receptor B2 em fígados infectados, quando comparados com fígados de camundongos normais. Os resultados obtidos nessa dissertação contribuem para o esclarecimento da atividade proteolítica citoplasmática do parasita, indicando alvos em potencial para formulação de novos antimaláricos e as alterações na fisiologia hepática, renal e pulmonar envolvendo a sinalização de cininas durante a infecção pelo Plasmodium chabaudi, possibilitando compreender a fisiopatologia da malária.