Fator de crescimento vascular endotelial na neovascularização corneana de camundongos

Abstract

Angiogenesis is defined as the formation of new vessels from existing vessels. It is a complex multistep process that includes proliferative migration and differentiation of endothelial cells, degradation of extracelluar matrix, microtubule formation, and sprouting of new capillary branches. Angiogenic factors such as basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor (EGF) have been used as angiogenic inducers. bFGF is the prototype member of 13 structurally related heparin-binding growth factors and it is known as a mitogen for several types of cells, including vascular endothelial cells and fibroblasts. Miquerol and collaborators have produced mice that express VEGF-LacZ. This was possible by inserting a gene identifier (reporter) 3i non-transcribed region of the endogenous VEGF gene. Thus, it was possible to produce VEGF mRNA containing the LacZ indentifier (reporter). The balance between angiogenic and antiangiogenic factors is responsible for the regulation of angiogenesis. Studies show the effects of a specific inhibitor of VEGF. VEGF TrapR1R2, which is a fusion protein of human Fc domain to the second domain and the third domain receptor R1 receptor R2 . This protein is able to sequester VEGF, antagonize and therefore prevent the formation of blood vessels. The objectives of this study are: demonstrate that mice cornea produces VEGF when stimulated by bFGF and to demonstrate that intraperitoneal administration of VEGF TrapR1R2 inhibits VEGF production and angiogenesis. Control pellets or pellets containing 80 ng bFGF were surgically implanted into wild-type C57BL/6 and VEGF-LacZ mouse corneas. The corneas were photographed, harvested, and the percentage of corneal NV was calculated. The corneas were evaluated for the expression of VEGF and neovascularization using Confocal Microscopy. VEGF-LacZ mice received tail vein injections of an endothelial-specific lectin after pellet implantation to determine the temporal and spatial relationship between VEGF expression and corneal NV using confocal microscopy. Western blot was used to analyze the presence of VEGF in corneas of mice that received wild implantation of pellets containing bFGF. Neovascularization was assessed on corneas that received the implant pellet containing bFGF after administration of intraperitoneal injections of VEGF TrapR1R2 or control IgG-Fc protein. NV of the corneal stroma began on day 4 and was sustained through day 21 following bFGF pellet implantation. Progression of vascular endothelial cells correlated with increased VEGF-LacZ expression. Western Blot analysis showed increased VEGF expression in the corneal NV zone. Following bFGF pellet implantation, the area of corneal NV in untreated controls was 1.05±0.12 mm² and 1.53±0.27 mm² at days 4 and 7, respectively. This was significantly greater than that of mice treated with VEGF TrapR1R2 (0.24±0.11 mm² and 0.35±0.16 mm² at days 4 and 7, respectively; p<0.05). The avascular cornea depends on a balance between various endogenous angiogenic factors (including VEGF , bFGF) and anti - angiogenic factors , when this balance is broken for some reason , corneal neovascularization occurs. This study suggests that the mice cornea produces VEGF when stimulated with bFGF. VEGF proteins are of great importance in corneal neovascularization, as function stimulating factors such as vascular endothelial cells. However, the specific mechanism of regulation of VEGF production by stimulation of bFGF has not yet been fully elucidated. It has been shown that injection of VEGF TrapR1R2 blocks the formation of blood vessels in the corneas of mice subjected to suturing. Using different technique to induce neovascularization, we demonstrate that VEGF TrapR1R2 blocks neovascularization in corneas that had implantation of sediments containing bFGF. More experiments are needed to dissect the role of bFGF in the production of VEGF and blocking using VEGF TrapR1R2. Probably, this mechanism contributes to the prevention of corneal neovascularization. The cornea of mice expressed VEGF after stimulation by bFGF. Systemic administration of VEGF TrapR1R2 blocks the vascularization of the mice cornea triggered by implanting pellets containing bFGF. Systemic administration of VEGF TrapR1R2 may have potential therapeutic applications in the management of corneal NV.

A angiogênese é o processo que se caracteriza pelo crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede vascular preeexistente. Trata-se de um processo complexo de múltiplos passos, que inclui proliferação, migração e diferenciação de células endoteliais, degradação de matriz extracelular, formação de microtúbulos e surgimento de novas ramificações capilares. Fatores angiogênicos tais como Fator de Crescimento Fibroblástico Básico (bFGF), Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF) e o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) têm sido usados como indutores angiogênicos. bFGF é o membro protótipo de 13 fatores de crescimento de ligação à heparina estruturalmente afins e é conhecido como um mitógeno para vários tipos de células, incluindo as células endoteliais vasculares e fibroblastos. Miquerol e colaboradores produziram camundongos que possuíam VEGF-LacZ. Isso foi possível inserindo-se um gene identificador (repórter) na região 3i não transcrita do gene endógeno do VEGF. Desta maneira, foi possivel produzir RNAm do VEGF que contém o identificador LacZ (repórter). O equilíbrio entre os fatores angiogênicos e antiangiogênicos é o responsável pela regulação da angiogênese. Estudos mostram os efeitos de um inibidor específico de VEGF: o VEGF TrapR1R2, que é a fusão da Proteína Humana de Domínio Fc com o segundo domínio do receptor R1 e o terceiro domínio do receptor R2 e que tem o poder de sequestrar e antagonizar o VEGF e, por consequência, prevenir a formação de vasos sanguíneos. Os objetivos deste estudo são: demonstrar que a córnea de camundongos produz VEGF quando estimulada por bFGF e demonstrar que a administração intraperitoneal de VEGF TrapR1R2 inibe a produção de VEGF e a angiogênese. Sedimentos controles e sedimentos contendo 80ng de bFGF foram cirurgicamente implantados em córneas de camundongos selvagens C57BL/6 e VEGF-LacZ. As córneas foram fotografadas e retiradas, e a porcentagem de vascularização da córnea foi calculada. As córneas foram avaliadas quanto à expressão de VEGF e neovascularização com uso de Microscopia Confocal. Após o implante de sedimentos contendo bFGF, camundongos VEGF-LacZ receberam injeções na veia da cauda de uma lectina endotelial específica para determinar a relação temporal e espacial entre a expressão de VEGF e neovascularização da córnea com uso microscopia confocal. Western Blot foi utilizado para análise da presença de VEGF em córneas de camundongos selvagens que receberam o implante de sedimentos contendo bFGF. Foi avaliada a neovascularização da córnea que recebeu o implante de sedimento contendo bFGF após a administração de injeções intraperitoneais de VEGF TrapR1R2 ou como controle de uma Proteína Humana de Domínio Fc (hFc). A neovascularização do estroma começou no quarto dia após o implante de sedimentos contendo bFGF e foi mantida até o vigésimo primeiro dia. A expressão de VEGF-LacZ correlacionou com a progressão das células vasculares endoteliais. A análise de Western blot mostrou aumento da expressão do VEGF na zona vascularizada da córnea. Após o implante de sedimentos contendo bFGF, a área de neovascularização da córnea em controles que não foram tratados foi de 1,05 ± 0,12 mm2 e 1,53 ± 0,27 mm2 para os dias 4 e 7, respectivamente. Isso foi significativamente maior do que a dos camundongos tratados com VEGF TrapR1R2 (0,24 ± 0,11 mm2 e 0,35 ± 0,16 mm2 para os dias 4 e 7, respectivamente, p<0,05). A córnea avascular depende de um balanço entre vários fatores angiogênicos endógenos (incluindo VEGF, bFGF) e fatores antiangiogênicos; quando este balanço é quebrado por algum motivo, ocorre a vascularização corneana. Este estudo sugere que a córnea de camundongo produz VEGF, quando estimulada com bFGF. As proteínas de VEGF são de grande importância na neovascularização corneana, pois funcionam como fatores estimulantes de células endoteliais vasculares. Entretanto, o mecanismo específico da regulação da produção de VEGF pela estimulação de bFGF ainda não foi inteiramente elucidado. Já foi demonstrado que a injeção de VEGF TrapR1R2 bloqueia a formação de vasos sanguíneos em córneas de camundongos submetidas a sutura. Utilizando técnica diferente para indução de neovascularização, nós demonstramos que VEGF TrapR1R2 bloqueia neovascularização em córneas que tiveram implante de sedimentos contendo bFGF. Mais experimentos são necessários para dissecar o papel de bFGF na produção de VEGF e o seu bloqueio com o uso de VEGF TrapR1R2. Provavelmente, este mecanismo contribuirá para a prevenção da neovascularização corneana. A córnea de camundongo expressa VEGF após o estímulo por bFGF. A administração sistêmica de VEGF TrapR1R2 bloqueia a vascularização da córnea de camundongo desencadeada pelo implante de sedimentos contendo bFGF. A administração sistêmica de VEGF TrapR1R2 pode ter potenciais aplicações terapêuticas no manejo da neovascularização da córnea.