Efeito do inibidor farmacológico de mTOR (rapamicina) na resposta de linfócitos T CD8+ gerados pela imunização prime-boost heteróloga

Abstract

Vaccination protocol known as heterologous prime-boost is a powerful strategy to elicit effector CD8+ T cells against the parasite Trypanosoma cruzi. It consists in the use of plasmid DNA, followed by a deficient recombinant human adenovirus type 5, both carrying the ASP-2 gene of T. cruzi. Published experimental viral infections, suggested that the inhibition of mTOR, a kinase involved in differentiation, metabolism, migration, and cell death mechanisms, enhances memory CD8+ T population. However, this method to promote a higher memory response in protozoan infection/immunization is not described. Thus, our aim was to analyze the role of rapamycin, the pharmacological inhibitor of mTOR, in immunization-induced CD8+ T response against T. cruzi. For this purpose, C57BL/6, A/Sn, or CD4+ knockout mice were immunized and treated daily with rapamycin during 35 days the evaluation of CD8+ T cell responses by immunophenotyping, intracellular staining, ELISPOT assay and in vivo cytotoxicity. Our results showed that rapamycin-based treatment enhanced the frequency of specific CD8+ T cells and the percentage of the polyfunctional population, which degranulates and secretes both IFN- and TNF, when compared to the immunized group. This Increasing was also observed 95 days after the first dose even in mice immunized with ten-fold lower doses of plasmid/adenovirus. Moreover, mice susceptible to experimental infection by T. cruzi immunized with reduced immunization doses, treated with rapamycin, and infected with trypomastigotes showed a survival rate of 100% whereas the immunized-group rate varied to 42%. Therefore, we sought to identify which CD8+ T cell mechanisms were being modulated by the inhibition of mTOR. It was seen that the in vivo proliferation was higher in the group treated with rapamycin, and CD8+ T effector and memory cells generated by immunization and treatment had a more energetic metabolic profile, which is closely related to function and differentiation of T cells. Taken together, our data provides a new approach to vaccines development against intracellular parasites, since rapamycin has an adjuvant effect on CD8+ T response through modulation of mTOR activity.

O regime de vacinação do tipo prime-boost heterólogo que utiliza DNA plasmidial recombinante na primeira dose, seguida de um reforço com adenovírus humano do tipo 5 deficiente em replicação, ambos expressando o gene da proteína ASP-2, tem se mostrado uma estratégia poderosa na indução de linfócitos T CD8+ específicos contra o protozoário Trypanosoma cruzi. Em infecções virais experimentais já publicadas, a inibição da mTOR, uma quinase envolvida em mecanismos de diferenciação, metabolismo, crescimento e morte celular, foi capaz de aumentar a frequência e qualidade da população de memória T CD8+. No entanto, este método para promover maior resposta de memória em infecções/imunizações por protozoários não foi descrito. Assim, nosso objetivo foi analisar o papel da rapamicina, o inibidor farmacológico da mTOR, na resposta T CD8+ induzida pela imunização prime-boost contra T. cruzi. Para este fim, camundongos das linhagens C57BL/6, A/Sn ou CD4(-/-) foram imunizados e tratados com rapamicina ou diluente durante 35 dias consecutivos para realização de imunofenotipagem e ensaios de avaliação da resposta imune, tais como marcação intracelular de citocinas, ELISPOT e citotoxicidade in vivo de linfócitos T CD8+. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com rapamicina aumentou a frequência de linfócitos T CD8+ específicos e a porcentagem de linfócitos polifuncionais, ou seja, que degranulam e secretam IFN- e TNF, quando comparados ao grupo apenas imunizado. Esse aumento também foi observado 95 dias após da primeira dose, mesmo em grupos imunizados com doses 10 vezes menores de plasmídeo/adenovírus. Além disso, camundongos A/Sn, que são suscetíveis à infecção experimental por T. cruzi, imunizados com doses reduzidas, tratados com rapamicina e infectados com tripomastigotas apresentaram sobrevivência de 100%, enquanto a taxa do grupo controle (somente imunizados) foi de 42%. Portanto, buscou-se quais mecanismos intrínsecos das células T CD8+ estavam sendo moduladas pela inibição de mTOR. Encontramos que a proliferação in vivo dos linfócitos T CD8+ foi maior no grupo tratado com rapamicina, e que estas células geradas pela imunização e tratamento tem um perfil metabólico mais energético, tanto na fase efetora ou de memória, o qual é intimamente ligado à função e diferenciação de células T de memória. Em conjunto, nossos dados fornecem uma nova abordagem para o desenvolvimento de vacinas contra infecções causadas por parasitas intracelulares, uma vez que a rapamicina tem efeito adjuvante na resposta T CD8+ por meio da modulação da atividade da mTOR.