Receptores estrogênicos regulam a expressão e a função de β-catenina e Galectina-3 em células de câncer de próstata independentes de androgênios DU-145

Abstract

O câncer prostático inicialmente responde bem à terapia de ablação androgênica, mas em muitos casos o tumor progride para um fenótipo independente de androgênios ou também denominado resistente à castração (CRPC, castration resistant prostate cancer), levando à metástase. Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento do CRPC ainda não estão esclarecidos. É possível que nuances da sinalização do receptor estrogênico (ER), ou modulação seletiva da sinalização do ER, possam influenciar favoravelmente os resultados no CRPC. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar a expressão de ERs e das proteínas β-catenina e Galectina-3 em células de câncer prostático independentes de androgênios DU-145 e PC-3, respectivamente, isoladas de metástases cerebral e óssea e em células epiteliais da próstata PNT1A (obtida de um homem pós-puberdade, considerada normal). Além disso, investigar os efeitos da ativação dos ERs na expressão das proteínas β-catenina e Galectina-3 em linhagens celulares de câncer prostático independentes de androgênios DU-145. Foi mostrado que: 1. Os clássicos receptores estrogênicos (ESR1 e ESR2) são diferencialmente expressos em células de câncer prostático independentes de androgênios PC-3 e DU-145 e em células epiteliais da próstata PNT1A. A expressão dos ERs foi maior em células DU-145 comparada a células PNT1A e PC-3. As expressões destes receptores em células PNT1A e PC-3 foram similares. Estes resultados sugerem que os androgênios e seus receptores não têm uma função direta na regulação da expressão basal dos ERs em células de câncer prostático independentes de androgênios. A expressão diferencial dos ERs observada entre as células DU-145 e PC-3, sugerem que outros fatores locais presentes nos diferentes sítios de metástase (cerebral e ósseo), de onde estas células foram obtidas, podem regular a expressão dos ERs. 2. β-catenina não fosforilada é diferencialmente expressas nestas células estudadas. A expressão basal controle (ausência de tratamento) da β-catenina não fosforilada foi maior em células DU-145 comparada a células PNT1A e PC-3, indicando uma correlação entre a expressão dos ERs e a expressão basal da β-catenina não fosforilada. Imunomarcação para β-catenina não fosforilada foi detectada predominantemente na membrana plasmática das células DU-145. O tratamento com o agonista seletivo do ESR2 (DPN) por 2 e 4 horas aumentou a imunomarcação para β-catenina não fosforilada preferencialmente na membrana plasmática, no citoplasma e no núcleo das células DU-145. O tratamento com o agonista seletivo do ESR1 (PPT) não alterou a imunomarcação da β-catenina não fosforilada nestas células. Estes resultados indicam o envolvimento do ESR2 na regulação da expressão e localização da β-catenina não fosforilada em células DU-145. 3. Galectina-3 é diferencialmente expressa em células de câncer prostático independentes de androgênios DU-145 e PC-3. A expressão basal controle (ausência de tratamento) da Galectina-3 foi maior em células PNT1A e DU-145 comparada células PC-3, confirmando que o AR não é o fator determinante na expressão de Galectina-3 em células prostáticas. Além disso, foi mostrado que não há correlação entre a expressão dos ERs e a expressão basal de Galectina-3 nestas células. Em células DU-145, imunomarcação para Galectina-3 foi observada no citoplasma e raros núcleos imunomarcados. O tratamento com β-estradiol (E2) ou com PPT por 4 horas levou a imunomarcação intensa para Galectina-3 no citoplasma e um aumento no número e da intensidade de núcleos imunomarcados. Este aumento da imunomarcação pela incubação com o PPT foi bloqueado pelo MPP, antagonista seletivo do ESR1. Por outro lado, o tratamento com DPN, por 2 e 4 horas, não alterou a imunomarcação basal. Estes resultados indicam o envolvimento do ESR1 na regulação da expressão da Galectina-3 em células DU-145. 4. Colocalização de Galectina-3 e β-catenina foi observada no citoplasma e em raros núcleos das células DU-145. 5. A ativação dos receptores estrogênicos pelo 17β-estradiol, PPT e DPN levou ao aumento da migração e da invasão das células DU-145. Esses efeitos foram bloqueados na presença dos antagonistas seletivos do ESR1 (MPP) e do ESR2 (PHTPP), sugerindo o envolvimento dos receptores estrogênicos na migração e na invasão das células DU-145. 6. Os pré-tratamentos com o disruptor da β-catenina (PKF 118-310) e com o inibidor da Galectina-3 (VA03) bloquearam os efeitos do 17β-estradiol, do PPT e do DPN, sugerindo o envolvimento dos receptores estrogênicos ESR1 e ESR2 e das proteínas (β-catenina e Galectina-3) na invasão das células DU-145. Em conclusão, a ativação do ESR1 e do ESR2, respectivamente, aumenta a expressão da Galectina-3 e da β-catenina em células DU-145. A ativação dos ERs aumenta a migração e a invasão destas células. Além disso, as proteínas β-catenina e Galectina-3 estão envolvidas na invasão celular ativada pelos ERs. A identificação de novas vias de sinalização tem importância para a melhor compreensão do câncer de próstata e no possível desenvolvimento de alvos terapêuticos para o tratamento do CRPC.

Prostate cancer is initially dependent on the androgen, gradually evolves into an androgen-independent form of the disease, also known as castration-resistant prostate cancer (CRPC). At this stage, current therapies scantily improve survival of the patient. The molecular mechanisms that lead to the development of CRPC are still unclear. It is possible that nuances of estrogen receptor (ER) signaling, or selective modulation of ER signaling, may favorably influence CRPC results. Thus, the aim of the present study is to investigate the effects of ER activation on β-catenin and Galectin-3 in DU-145 and PC-3 androgen-independent prostate cancer cells, respectively isolated from brain and bone metastases. It was shown that: 1. The classical estrogen receptors (ESR1 and ESR2) are differentially expressed in androgen-independent in prostate cancer cells and in prostate epithelial cells PNT1A (human post pubertal prostate normal cells). The expression of ERs was higher in DU-145 cells compare to PNT1A and PC-3 cells. The expressions of these receptors in PNT1A and PC-3 cells were similar. These results suggest that androgens and their receptors do not play a direct role in regulating the expression of ERs in androgen-independent prostate cancer cells. The differential expression of ERs between DU-145 and PC-3 cells indicate that local factors present in the tumor microenvironment are involved in regulating the expression of these receptors. 2. non-phosphorylated β-catenin is differentially expressed in these cells. The basal expression (control, no treatment) of non-phosphorylated β-catenin was higher in DU-145 cells compared to PNT1A and PC-3 cells, indicating a correlation between the expression of ERs and the basal expression of non-phosphorylated β-catenin. Immunostaining for non-phosphorylated β-catenin was detected predominantly in the plasma membrane of DU-145 cells. Treatment with the selective ESR2 agonist (DPN) for 2 and 4 hours increased the immunostaining for non-phosphorylated β-catenin in the cytoplasm and nuclei of DU-145 cells. Treatment with the selective ESR1 agonist (PPT) did not change the immunostaining of non-phosphorylated β-catenin in these cells. These results indicate the involvement of ESR2 in regulating the expression and localization of non-phosphorylated β-catenin in DU-145 cells. 3. Galectin-3 is differentially expressed in DU-145 and PC-3 androgen-independent prostate cancer cells. Basal expression (control, no treatment) of Galectin-3 was higher in PNT1A and DU-145 cells compared to PC-3 cells, confirming that AR is not the determining factor in the expression of Galectin-3 in prostate cells. Furthermore, it was shown that there is no correlation between the expression of ERs and the basal expression of Galectin-3 in these cells. In DU-145 cells, weak immunostaining for Galectin-3 was observed in the cytoplasm and rare immunostained nuclei. Treatment with β-estradiol (E2) or with PPT for 4 hours induced intense immunostaining for Galectin-3 in the cytoplasm and an increase in the number and intensity of immunolabeled nuclei. This increase in immunostaining by incubation with PPT was blocked by MPP, a selective antagonist of ESR1. On the other hand, treatment with DPN, for 2 and 4 hours, did not change the basal immunostaining. These results indicate the involvement of ESR1 in regulating the expression of Galectin-3 in DU-145 cells. 4. Colocalization of Galectin-3 and β-catenin was observed in the cytoplasm and in rare immunostained nuclei of DU-145 cells. 5. The activation of estrogen receptors with 17β-estradiol, PPT and DPN induced to increased migration and invasion of DU-145 cells. These effects were blocked in the presence of selective ESR1 (MPP) and ESR2 (PHTPP) antagonists, suggesting the involvement of estrogen receptors in the migration and invasion of DU-145 cells. 6. Pretreatments with the β-catenin disruptor (PKF 118-310) and with the Galectin-3 inhibitor (VA03) blocked the effects of 17β-estradiol, PPT and DPN, suggesting the involvement of estrogen receptors ESR1 and ESR2 and proteins (β-catenin and Galectin-3) in the invasion of DU-145 cells. In conclusion, activation of ESR1 and ESR2, respectively, increases the expression of Galectin-3 and β-catenin in DU-145 cells. Activation of ERs increases the migration and invasion of these cells. In addition, β-catenin and Galectin-3 proteins are involved in ER-activated cell invasion. The identification of new signaling pathways is important in the development of therapeutic targets for the treatment of CRPC.