Efeito do rna interferente como modulador de resistência à epirrubicina sobre os níveis de expressão do gene abcb1 em linhagem de células ags de câncer gástrico quimiorresistentes

Abstract

Acquired resistance to chemotherapy is a major obstacle to successful gastric cancer treatment. Generally, the multidrug resistance (MDR) is characterized by overexpression of ATP-dependent drug-efflux pumps P-glycoprotein (Pgp), more recently known as ABCB1 protein. Different approaches to reversal the tumor cell chemoresistance has shown nice results in cancer chemotherapy by the utilization of MDR modulators, although, the major problem in this approach is the adverse side-effects which might happen if there is no selectivity by the modulator. On the other hand, the overexpression of drug-transporter proteins, such as ABCB1, can be disrupted by using RNA interference (RNAi) technologies. AIM: To establish an epirubicin-resistant cell subline (AGS/EPI) from human gastric adenocarcinoma AGS cells, and reversal of MDR phenotype by siRNA through silencing ABCB1 gene in GC cell subline AGS/EPI, and hence increase the success of chemotherapy treatment by reversing the resistance to epirubicin. Materials and Methods: The AGS/EPI cell subline was developed by exposing the parental AGS cells to stepwise increasing concentrations of anticancer drug EPI. ABCB1 protein localization and evaluation of siRNA transfection efficiency were measured by FACS. Localization and fluorescence spectral properties of the epirubicin were verified by Laser scanning confocal microscopy analysis. The relative mRNA expression of ABCB1 was determined using qRT-PCR. The in vitro cytotoxicity assays were performed by MTT colorimetric assay. The apoptosis was measured by DNA fragmentation analysis, and trypan blue exclusion staining. Statistical calculations were performed using Minitab V16.0 software. Results: The ABCB1 mRNA expression levels in AGS/EPI cell subline was 1.923 times higher than the AGS cell line. In contrast, the ABCB1 gene knockdown cell line (AGS/EPI-siRNA) was 0.370 less resilient than the AGS cell line. The AGS/EPI cell subline showed low sensitivity to EPI, on the other hand, AGS/EPI-siRNA showed a significant reduction of chemoresistance to EPI. Conclusion. The developed of epirubicin-resistant cell subline was successfully established, and the overexpression of ABCB1 protein has emerged as an important risk factor for EPI treatment failure of this CG cell subline. The ABCB1 gene knockdown by RNAi technology enhances the EPI sensitivity by reducing the efflux of the drug, and consequently increases the success of the treatment.

Introdução: A resistência aos quimioterápicos no tratamento de neoplasias vem sendo um obstáculo aos oncologistas. Dentre as diversas formas de resistência a múltiplos fármacos (RMF), a superexpressão da proteína transportadora ABCB1 tem grande participação neste evento. A quimiorresistência adquirida durante o tratamento do câncer gástrico (CG) está associada, principalmente, à superexpressão desta proteína. Embora alguns fármacos de efeito modulador de RMF atuem interferindo no funcionamento da proteína ABCB1, suas toxicidades limitam o seu uso na clínica. Por outro lado, o RNA interferente (RNAi), bloqueia especificamente o RNA mensageiro (RNAm) inibindo a expressão da proteína ABCB1, o que pode ser uma ferramenta eficiente para reverter o fenótipo de RMF e aumentar o sucesso da quimioterapia. Objetivo: Tornar a linhagem de células AGS de CG resistente à epirrubicina (EPI), em seguida, reverter esta quimiorresistência pelo silenciamento gênico responsável pela codificação da proteína ABCB1 através da inibição seletiva do RNAm via RNAi. Materiais e Métodos: Desenvolvemos a sub-linhagem resistente à EPI (AGS/EPI) por exposição de células AGS às concentrações crescentes de EPI. Localizamos a proteína ABCB1 e a eficiência de transfecção de siRNA por citometria por fluorescência (FACS). Verificamos a localização e as propriedades espectrais de fluorescência da EPI por análise de microscopia confocal. Determinamos a expressão relativa do RNAm de gene ABCB1 por qRT-PCR. Quantificamos a citotoxicidade in vitro pelo ensaio colorimétrico MTT. Avaliamos a apoptose pelos ensaios de fragmentação do DNA e método de azul de Trypan. Utilizamos o software Minitab V16.0 para as análises estatísticas. Resultados: Os níveis de expressão de RNAm do gene ABCB1 na sub- linhagem celular AGS/EPI foram 1,923 vezes mais elevados que a linhagem celular AGS. Em contraste, a sub-linhagem knockdown do gene ABCB1 (AGS/EPI-siRNA) foi 0,370 menos resistente que a linhagem celular AGS. A sub-linhagem celular AGS/EPI apresentou baixa sensibilidade à EPI, por outro lado, AGS/EPI-siRNA demonstrou redução de quimiorresistência à EPI. Adicionalmente, a sub-linhagem AGS/EPI-siRNA apresentou uma correlação positiva entre estes níveis de expressão de RNAm do gene ABCB1 e a reversão da quimiorresistência adquirida à EPI. Conclusão. Desenvolvemos a sub-linhagem AGS/EPI epirrubicina-resistente com sucesso, a superexpressão da proteína ABCB1 emergiu como um importante fator de risco para o fracasso no tratamento com EPI nesta sub-linhagem de CG. O knockdown do gene ABCB1 pela tecnologia RNAi aumenta a sensibilidade a EPI pela redução do efluxo deste fármaco, e consequentemente eleva o sucesso ao tratamento.