Mecanismos De Sinalização Celular Envolvidos Na Secreção De Il-8 Por Células Epiteliais Durante A Interação Com Histoplasma Capsulatum, Quimiotipos I E Ii

Abstract

Histoplasma capsulatum var. capsulatum is the causative agent of histoplasmosis, a systemic human mycosis with a worldwide distribution. The absence or presence of ( 1,3)glucan on the yeast surface of H. capsulatum classifies the isolates of this fungus into chemotypes I or II, respectively. In this work, we verified that, by indirect immunofluorescence and flow cytometry, isolates 496 and 268 of H. capsulatum showed reactivity with the monoclonal antibody that recognizes ( 1,3)glucan, thus classifying isolates 496 and 268 as being of chemotype II. Subsequently, from the cultures of these isolates, we spontaneously selected mutants of H. capsulatum that did not have ( 1,3)glucan on their surface. These mutants were named 496L and 268L and, in contrast to wild isolates, did not possess ( 1,3)glucan on the fungal surface and, when cultured in a solid medium, formed smooth colonies. We demonstrated that both chemotype II isolates (496 and 268) and their respective mutants induced, at similar levels, IL8 chemokine secretion by A549 human lung epithelial cells. We observed that the wildtype G217B chemotype isolate also induced a statistically significant increase in IL8 levels relative to the basal levels secreted by epithelial cells, but this secretion was lower when compared to the secretion promoted by the chemotype II fungus 268. We then analyzed some cell signaling pathways that are activated by these fungi in A549 cells. Our results demonstrated that the contact of the A549 cells with yeasts of H. capsulatum, isolated 268 and G217B and with the mutant 268L, promoted the activation of SFKs, Syk and PKC δ. In addition, using specific inhibitors for the activation of SFKs (PP2) and Syk (PRT062607), we found that the activation of SFKs was more relevant for IL8 secretion when the cells were infected with the H. capsulatum 268 isolate and its 268L mutant, whereas Syk activation was important for IL8 secretion during infection with G217B. On the other hand, using a PKC δ inhibitor (PIPKC δ), we observed that activation of PKC δ is important for IL8 secretion by A549 epithelial cells during infection with both 268 and G217B isolates and or the mutant (268L). In addition, during the interaction of A549 cells with the fungi studied, there is a feedback between SFKs and Syk. Thus, together, these results show for the first time that H. capsulatum chemotypes I and II promote, in human epithelial cells, different levels of IL8 that are dependent on the different signaling pathways.

Histoplasma capsulatum var. capsulatum é o agente etiológico causador da histoplasmose, uma micose humana sistêmica com distribuição mundial. A ausência ou presença da ( 1,3)glucana na superfície das leveduras de H. capsulatum classifica os isolados deste fungo em quimiotipos I ou II, respectivamente. Neste trabalho, verificamos que, por imunofluorescência indireta e citometria de fluxo, os isolados 496 e 268 de H. capsulatum apresentaram reatividade com o anticorpo monoclonal que reconhece ( 1,3)glucana, assim classificamos os isolados 496 e 268 como sendo de quimiotipo II. Posteriormente, a partir das culturas destes isolados, selecionamos espontaneamente clones de H. capsulatum que não apresentavam ( 1,3)glucana em sua superfície. Estes clones foram denominados de 496L e 268L e, contrastando com os isolados selvagens, não possuíam ( 1,3)glucana na superfície fúngica e, quando em cultura em meio sólido, formavam colônias lisas. Demonstramos que ambos os isolados de quimiotipo II (496 e 268) e seus respectivos clones induziram, em níveis semelhantes, a secreção da quimiocina IL8 pelas células epiteliais de pulmão humano A549. Observamos que o isolado selvagem de quimiotipo I G217B também induziu aumento estatisticamente significante nos níveis de IL8 em relação aos níveis basais secretados pelas células epiteliais, porém, esta secreção foi menor quando comparada à secreção promovida pelo fungo de quimiotipo II 268. Posteriormente, analisamos algumas vias de sinalização celular que são ativadas por estes fungos nas células A549. Nossos resultados demonstraram que o contato das células A549 com as leveduras de H. capsulatum, isolados 268 e G217B e com o clone 268L, promoveu a ativação de SFKs, Syk e PKC δ. Além disso, utilizando inibidores específicos para a ativação de SFKs (PP2) e Syk (PRT062607), verificamos que a ativação das SFKs foi mais relevante para a secreção de IL8 quando as células foram infectadas com o isolado de H. capsulatum 268 e o seu clone 268L, enquanto que a ativação de Syk foi importante para a secreção de IL8 durante a infecção com G217B. Por outro lado, utilizando um inibidor de PKC δ (PIPKC δ), observamos que a ativação de PKC δ é importante para a secreção de IL8 pelas células epiteliais A549 durante a infecção com ambos os isolados (268 e G217B) e o clone (268L). Além disso, durante a interação das células A549 com os fungos estudados, há ocorrência de um feedback entre SFKs e Syk. Assim, conjuntamente, estes resultados mostram pela primeira vez que os quimiotipos I e II de H. capsulatum promovem, em células epiteliais humanas, níveis diferentes de IL8 que são dependentes de vias distintas de sinalização.