Efeito do exercício físico nas alterações inflamatórias e comportamentais causadas por crises no modelo de epilepsia lesional induzida por pilocarpina

Abstract

Introduction: Mesial Temporal Lobe Epilepsy (ELTM) is a more prevalent form among epilepsies, representing about 40% of all cases and 60% of temporal lobe epilepsies (TLE). A hippocampal sclerosis is a pathophysiological alteration most frequently observed in the ELTM. Cell death in ELTM has been associated with the cognitive impairment present in many patients who also have seizures resistant to antiepileptic drug treatment. Neuroinflammation and oxidative stress have been reported as key factors in the development and progress of ELTM. Recent studies show an association between klotho protein decline, responsible for regulating phosphate excretion and vitamin D synthesis in the kidney, with age-related changes, cognitive impairment mainly. The experimental model of pilocarpine-induced lesion epilepsy reproduces the main electrophysiological, pathophysiological and behavioral characteristics of ELTM. It has been widely used to investigate mechanisms involved with epileptogenesis, aiming at new therapeutic approaches. The effect of exercise on neuroinflammatory and behavioral changes was tested in the present study. Objectives: Evaluate the effect of aerobic exercise on behavioral (seizure frequency, locomotion, anxiety and memory) and molecular (klotho protein expression and P2X7 proinflammatory markers, cytokines and NLRP3 proteasome) changes in the brain of rats submitted to lithium-associated pilocarpine lesional epilepsy model. Methods: Adult Wistar rats were injected with lithium chloride (127 mM / kg, i.p.) and 18 h after with methylscopolamine (1 mg / kg, s.c.) followed by pilocarpine (30 mg / kg, s.c.) 20 min after for induction of status epilepticus (SE). Both animals that presented 2 h of SE and controls treated with saline, instead of pilocarpine, were submitted to voluntary aerobic exercise training for 30 days. After this period, the animals that received pilocarpine were filmed for 30 days to evaluate the frequency of seizures. After this period, all animals of the studied groups were submitted to behavioral tests: open field locomotion, discriminative avoidance and object recognition. At the end of the behavioral tests, the animals were euthanized and the hippocampus homogenized for the analysis of TNF-α, IL-1β and IL-6 by ELISA, and Western blot P2X7, NLRP3 and klotho proteins. Results: The data showed that epileptic rats that exercised presented smaller number of seizures compared to sedentary epileptic rats, however, there were no differences regarding anxiety, locomotion and memory parameters between groups. Biochemical analyzes showed that epileptic rats had high levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, P2X7 and NLRP3 in the hippocampus and exercise significantly reduced these markers. There was no significant difference in klotho protein quantification between the epilepsy and control groups, with and without exercise, although the data show an increase in the average concentration of epileptic animals xix compared to the control group. Conclusion: Physical exercise has been shown to be beneficial because it reverses most of the molecular changes caused by seizures. Exercise reduced P2X7 receptor expression as well as cytokines and NLRP3 inflammasome in the hippocampus. Exercise caused a reduction in seizure frequency and this may be a result of the decrease in expression of the pro-inflammatory markers studied. However, no behavioral changes in locomotion, anxiety and cognitive impairment were detected, as well as no significant difference in klotho protein expression in the hippocampus of exercise and sedentary epilepsy rats compared to their respective controls. Further studies employing larger numbers of older animals may unravel the role of klotho protein in cognitive impairment associated with epilepsy in preclinical models and clinical studies.

Introdução: A Epilepsia do Lobo Temporal Mesial (ELTM) é a forma mais prevalente dentre as epilepsias, representando cerca de 40% de todos os casos e 60% das epilepsias do lobo temporal (ELT). A esclerose hipocampal é a alteração fisiopatológica mais frequentemente observada nas ELTM. A morte celular na ELTM tem sido associada ao déficit cognitivo presente em muitos pacientes que também apresentam crises farmacorresistentes ao tratamento com drogas antiepilépticas. A neuroinflamação e o estresse oxidativo têm sido citados como fatores chave na gênese e progressão da ELTM. Estudos recentes mostram a associação entre o declínio da proteína klotho, responsável por regular a excreção de fosfato e a síntese de vitamina D no rim, com alterações relacionadas ao envelhecimento, principalmente o déficit cognitivo. O modelo experimental de epilepsia lesional induzido por pilocarpina reproduz as principais características eletrofisiológicas, fisiopatológicas e comportamentais das ELTM, e tem sido muito utilizado na investigação de mecanismos envolvidos com a epileptogênese visando novas abordagens terapêuticas. O efeito do exercício físico sobre alterações neuroinflamatórias e comportamentais foi testado no presente estudo. Objetivos: Avaliar o efeito do exercício físico aeróbico nas alterações comportamentais (frequência das crises, locomoção, ansiedade e memória) e moleculares (expressão da proteína klotho e marcadores pró-inflamatórios P2X7, ctiocinas e proteassoma NLRP3) no cérebro de ratos submetidos ao modelo de epilepsia lesional induzido por pilocarpina associada ao lítio (LI-Pilo). Métodos: Ratos Wistar, adultos, foram injetados com cloreto de lítio (127 mM/kg, i.p.) e 18 h após com metilescopolamina (1mg/kg, s.c.) seguido por pilocarpina (30 mg/kg, s.c.) 20 min após, para a indução do status epilepticus (SE). Tanto os animais que apresentaram 2h de SE como os controles tratados com salina, ao invés de pilocarpina, foram submetidos a treinos de exercício físico aeróbico em roda voluntária por 30 dias. Após esse período, os animais que receberam pilocarpina, foram filmados durante 30 dias para avaliação da frequência de crises. Passado esse período todos os animais dos grupos estudados foram submetidos à testes comportamentais: Locomoção em campo aberto, esquiva discriminativa e reconhecimento de objetos. Ao término dos testes comportamentais, os animais foram eutanasiados e os hipocampos homogeneizados para as análises de TNF-α, IL-1β e IL-6 por ELISA, e das proteínas P2X7, NLRP3 e klotho por Western-blot. Resultados: Os dados mostraram que ratos epilépticos que fizeram exercícios apresentaram menor número de crises comparados à ratos epilépticos sedentários, porém, não se verificou diferenças quanto aos parâmetros de ansiedade, locomoção e memória entre os grupos. As análises bioquímicas mostraram que ratos epilépticos apresentaram altos níveis de TNF-α, IL- xvii 1β, IL-6, P2X7 e NLRP3 no hipocampo e o exercício reduziu significativamente esses marcadores. Não houve diferença significante na quantificação da proteína klotho entre os grupos epilepsia e controle, com e sem exercício, embora os dados evidenciem um aumento na concentração média dos animais epilépticos em relação ao grupo controle. Conclusão: O exercício físico se mostrou benéfico por reverter boa parte das alterações moleculares causadas por crises. O exercício reduziu a expressão dos receptores P2X7, bem como as citocinas e o inflamassoma NLRP3 no hipocampo. O exercício causou redução na frequência de crises e isso pode ser resultado da queda na expressão dos marcadores pró-inflamatórios estudados. Entretanto, não foram detectadas alterações comportamentais de locomoção, ansiedade e déficit cognitivos, assim como não houve diferença significante na expressão da proteína klotho no hipocampo de ratos do grupo epilepsia exercício e sedentário comparado aos seus respectivos controles. Novos estudos empregando maior numero de animais com idades mais avançadas poderão desvendar o papel da proteína klotho no déficit cognitivo associado à epilepsia em modelos pré-clínicos, e em estudos clínicos.