| dc.description.abstract | Em trabalho realizado por nosso grupo foi demonstrado que Macrófagos
(MΦ) de camundongos CBA controlam a infecção por L. major e são
permissivos à L. amazonensis, sugerindo um papel importante destas células
na resolução da infecção. Com intuito de identificar potenciais alvos
envolvidos na infecção por Leishmania, utilizou-se uma abordagem
proteômica, e dentre as proteínas identificadas, foi observado que a
expressão da Proteína Translocadora (TSPO), está negativamente modulada
na infecção por L. amazonensis. Assim, o presente trabalho visa avaliar o
papel do TSPO na infecção por Leishmania. Inicialmente, a sequência do
gene do TSPO foi obtida por RT-PCR a partir de RNAm de macrófagos de
camundongo CBA infectados com L. major e clonada no pcDNA6.2/CEmGFP-
DEST utilizando o sistema Gateway™. A clonagem do TSPO foi
confirmada por sequenciamento e alinhamento com a sequência deste gene
disponível no GenBank. Para obtenção de clones sobre-expressando o
TSPO, células de linhagem macrofágica J774 foram submetidas à
transfecção estável com os plasmídeos pcDNA6.2-TSPO e pcDNA6.2. As
células transfectadas com o pcDNA6.2-TSPO apresentaram baixa taxa de
sobrevivência em comparação com o controle. A fim de avaliar a
funcionlidade do plasmídeo, células CHO foram transfectadas de forma
transitória com o pcDNA6.2-TSPO e com imunofluorescência foi
demonstrado que as células CHO pcDNA6.2-TSPO apresentaram marcação
mais intensa que as CHO pcDNA6.2. Uma vez confirmada a funcionalidade
do plasmídeo, foi realizada nova tentativa de transfecção estável de células
J774 com pcDNA6.2-TSPO. Apesar destas células continuarem a apresentar
alta letalidade, foram obtidos dois clones: J774 pcDNA6.2-TSPO clone 1 e
J774 pcDNA6.2-TSPO clone 2. A expressão do TSPO mostrou-se
aumentada 2,09 vezes nas J774 pcDNA6.2-TSPO clone 2 em comparação
com J774 no entanto o clone 1 apresentou uma alteração da expressão do
TSPO pouco significativa em comparação ao controle, por análise
quantitativa de western-blot. Em seguida, os diferentes clones foram
infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e não foi
observada diferença no percentual de células infectadas nem no número de
parasita por células infectadas entre J774 pcDNA6.2-TSPO clone 1 e os
controles. Entretanto, o clone 2 apresentou uma redução no número de
células infectadas, no tempo de 6 horas. Essa redução não foi observada no
tempo de 48 horas. Nossos dados sugerem que a sobre-expresão do TSPO
reduz a fase inicial da infecção de células J774 por L. amazonensis. Visto
que, foi realizada apenas um experimento em triplicata faz-se necessário o
desenvolvimento de estudos adicionais para elucidar o papel desempenhado
pelo TSPO na infecção por Leishmania. | |
