Indução da diferenciação de células derivadas de tecido adiposo em células da linhagem osteogênica

Abstract

The stem cells have potential application to tissue regeneration or tissue engineering. Due to ethical and legal aspects alternative sources are being considered. Several researchers concentrate the studies on adult stem cells, mainly those derived of bone marrow stromal cells. Nevertheless, recent data proved that adult stem cells can also be isolated from adipose tissue (PLA) obtained by liposuction. These cells are able to differentiate into a diversity of mesodermal tissue and among them, bone tissue. The osteoinduction process depends on several factors and consists of mesenquimal stem cells differentiating into osteoprogenitor cells. Frequently, the osteoinduction culture media contains recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP-4) or DAG (dexamethasone, ascorbate acid and -glycerophosphate). This study aims to evaluate the adipose tissue derived stem cells adhesion, proliferation, differentiation into osteoblasts in vitro using either (rhBMP-4) or DAG. Adult stem cells derived from adipose tissue were obtained from three human subjects by liposuction realized by Plastic Surgery Service (Hospital São Lucas- PUCRS). After tissue dissociation by collagenase treatment, the cells were quantified, characterized with regard to cell membrane markers, and cultured in media containing rhBMP-4 or DAG, and control (only standard medium). The cultures were evaluated in 7, 14 and 21 days after induction. The expression of alkaline phosphate, osteopontin and osteocalcin were evaluated by PCR standard technique in cultured cells derived from adipose tissue obtained from two subjects. The expression of osteopontin and osteocalcin in one culture was determined by Real Time PCR technique. Moreover, alkaline phosphatase and von Kossa staining was performed to demonstrate the differentiation into mature osteoblasts by matrix mineralization. The average number of adult stem cells derived from adipose tissue was 1. 2x107/mL. The frequency of CD34 and CD117 markers were similar, 0. 73% and 0. 72% respectively. The frequency of CD105 was higher in the three samples. This study showed that the adult stem cells derived from adipose tissue cultivated or not in osteogenic media adheres and proliferates. Also, we demonstrate the presence of mature osteoblasts when cells were cultured in the presence of medium containing rhBMP-4 or DAG by the expression of osteogenic lineage markers such as alkaline phosphatase, osteopontin, and osteocalcin. Cells cultivated in media containing DAG have also shown deposition of bone matrix protein.

A aplicação de diferentes células-tronco na regeneração de tecidos lesionados ou na engenharia de tecidos tem recebido grande atenção. Devido às dificuldades práticas de obtenção de células-tronco embrionárias e considerando os aspectos éticos e legais, inúmeros pesquisadores têm realizado seus estudos com células-tronco adultas, principalmente aquelas derivadas do estroma da medula óssea. No entanto, estudos recentes comprovam que essa população celular também pode ser isolada do tecido adiposo (PLA) obtida através de lipoaspiração. Esse tipo de célula tem a característica de se diferenciar numa variedade de tecidos mesodérmicos, dentre eles o tecido ósseo. O processo de osteoindução é influenciado por vários fatores e consiste na indução de células-tronco mesenquimais indiferenciadas a formarem células osteoprogenitoras. Os fatores osteoindutores utilizados mais freqüentemente são a rhBMP-4 ou DAG (Dexametasona/ácido ascórbico/b-glicerolfosfato). Este estudo teve como objetivo avaliar a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo quando cultivadas em meio indutor específico, contendo rhBMP-4 ou DAG. Células-tronco adultas foram obtidas do tecido adiposo de três pacientes pela técnica de lipossucção, realizada pelo Serviço de Cirurgia Plástica do Hospital São Lucas da PUCRS. Após tratamento com colagenase para dissociação do tecido, as células foram quantificadas, caracterizadas com relação aos marcadores de membrana celular e cultivadas em meio contendo rhBMP-4, DAG ou convencional (controle). As culturas foram avaliadas no 7º, 14º e 21º dia após indução em meio específico.A expressão da fosfatase alcalina, osteopontina e osteocalcina foram avaliadas pela técnica de RT-PCR nas culturas de células derivadas do tecido adiposo de dois pacientes. A expressão das proteínas osteopontina e osteocalcina foi determinada pela técnica do PCR em tempo real em uma cultura de células derivada de um paciente. Igualmente, nesta mesma cultura foram realizada colorações para fosfatase alcalina e von Kossa para demonstrar a diferenciação das células-tronco mesenquimais (MSC) em células osteoblásticas pela detecção da transformação osteoblástica e mineralização da matriz. O número médio de células tronco adultas derivadas de tecido adiposo foi de 1,2 x 107/mL. A média da freqüência de expressão dos marcadores CD34 e CD117 foram semelhantes, 0,73% e 0,72%, respectivamente, embora tenha ocorrido uma grande variação entre as amostras. Para os marcadores CD45 e CD105 a média das freqüências foram de 1,17% e 1,57%, respectivamente. A freqüência do CD105 foi mais elevada nas três amostras. Este estudo mostrou que as células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo cultivadas, ou não em meio osteogênico aderem e proliferam em cultura, sofrem osteoindução e expressam proteínas marcadoras da linhagem osteogênica como a fosfatase alcalina, osteocalcina e osteopontina. Células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo são capazes de realizar a deposição de matriz mineralizada somente quando cultivadas em meio contendo DAG.