O leite de ovelha é um produto rico que permite elevado rendimento industrial na produção de derivados como o leite fermentado por grãos de Kefir. O consumo do Kefir está associado a benefícios à saúde, tais como: capacidade na proliferação gastrointestinal, espectro antibacteriano, efeito hipocolesterolêmico, atividade β-galactosidase, atividade antioxidante e reforço do sistema imunitário; também é considerado uma fonte de cepas probióticas e de peptídeos bioativos (PBA) que são liberados das proteínas do leite no decorrer da fermentação dos microrganismos presentes nos grãos ou por meio da digestão. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização microbiológica, bioquímica e funcional do leite de ovelha fermentado por grãos de kefir após o processo de digestão in vitro. O leite fermentado foi produzido com leite comercial UHT no primeiro trabalho e leite de ovelha pasteurizado nos trabalhos subsequentes; em ambos os grãos de kefir foram adicionados na proporção de 5% (m/v), a fermentação foi realizada a 21°C por ~40h. Com os leites fermentados prontos, realizou-se digestões in vitro que simula a digestão humana (com ácido, enzimas digestivas e bile), ao final foram isolados microrganismos aos quais foram testados para características probióticas: atividade antagonista, resistência a antibióticos, atividade antioxidante, atividade de beta-galactosidase, auto-agregação, hidrofobicidade, teste de aderência in vitro em células epiteliais. Nos ensaios com os peptídeos foram utilizadas a eletroforese e a espectrometria de massa para avaliar o perfil durante o processo de digestão in vitro; após esta digestão frações foram separadas frações de pesos moleculares abaixo de 3kDa por ultrafiltração e atividades biológicas (antimicrobiana, antioxidante, anti-hipertensiva e anti-hemolítica) foram testadas. Após a digestão do leite UHT fermentado foram isolados 28 Saccharomyces cerevisae identificados por métodos clássicos e confirmação da espécie por análise do DNA. A partir da digestão do leite de ovelha fermentado 24 cepas de Lactobacillus sp. foram isoladas e 3 identificadas como L. rhamnosus. Os microrganismos isolados apresentaram: antagonismo contra bactérias patogênicas, atividade beta-galactosidase (destacando-se os 3 L. rhamnosus que produziram em média 45.32 U/mg), atividade antioxidante (2 S. cerevisae com atividade acima de 90%), atividade hidrofóbica acima de 90% (19 S. cerevisae e 2 L. rhamnosus), capacidade de auto-agregação acima de 60% com 4h de estudo, e capacidade de adesão em células epiteliais intestinais de camundongos. S. cerevisae e L. rhamnosus apresentaram potencial uso como probióticos. Nos ensaios de PBA, foram observados um total de 134 peptídeos gerados durante digestão, 60 foram identificados por correlação na literatura e 12 com bioatividade já relatadas. Um PBA (661.8Da) foi resistente ao processo digestivo. As atividades antimicrobiana, antioxidante, anti-hipertensiva e anti-hemolítica foram observadas em todas as frações estudadas de 5-0.625 mg/mL. A fração extraída após toda a simulação da digestão, apresentou os melhores resultados. Os testes in vitro foram válidos para apontar L. rhamnosus Lb16 para aplicações probióticas in vivo. Os PBA encontrados no presente estudo indicam propriedades multifuncionais, têm potencial para identificação das sequências de aminoácidos que conferem cada bioatividade, isto pode permitir a síntese, purificação e aplicação no desenvolvimento de produtos nutracêuticos e na indústria biotecnológica.CAPESSheep's milk is a rich product that allows high industrial yield in the production of derivatives such as milk fermented by grains of Kefir. Kefir consumption is associated with health benefits such as: gastrointestinal proliferation capacity, antibacterial spectrum, hypocholesterolemic effect, β-galactosidase activity, antioxidant activity and immune system enhancement; is also considered a source of probiotic strains and bioactive peptides (BAPs) that are released from milk proteins during the fermentation of the microorganisms present in the grains or through digestion. The objective of this work was to perform the microbiological, biochemical and functional characterization of sheep milk fermented by kefir grains after the in vitro digestion process. Fermented milk was produced with UHT commercial milk in the first part of work and pasteurized sheep's milk in the subsequent works; in both kefir grains were added in the proportion of 5% (w/ v), the fermentation was performed at 21 °C for ~40h. With the fermented milks prepared, in vitro digestions were performed to simulate human digestion (with acid, digestive enzymes and bile). At the end, microorganisms were tested and tested for probiotic characteristics: antagonistic activity, resistance to antibiotics, antioxidant activity, beta-galactosidase activity, auto-aggregation, hydrophobicity, in vitro adherence test in epithelial cells. In the peptide assays, electrophoresis and mass spectrometry were used to evaluate the profile during the in vitro digestion process; after this digestion fractions were separated molecular weight fractions below 3kDa by ultrafiltration and biological activities (antimicrobial, antioxidant, antihypertensive and anti-hemolytic) were tested. After the digestion of the fermented UHT milk, 28 Saccharomyces cerevisae were identified by classical methods and confirmation of the species by DNA analysis. From the digestion of fermented sheep's milk, 24 strains of Lactobacillus sp. were isolated and 3 identified as L. rhamnosus. The isolated microorganisms presented: antagonism against pathogenic bacteria, beta-galactosidase activity (especially 3 L. rhamnosus that produced on average 45.32 U/ mg), antioxidant activity (2 S. cerevisae with activity above 90%), hydrophobic activity above 90% (19 S. cerevisae and 2 L. rhamnosus), autoaggregation capacity above 60% with 4h of study, and capacity of adhesion in intestinal epithelial cells of mice. S. cerevisae and L. rhamnosus showed potential use as probiotics. In the PBA assays, a total of 134 peptides generated during digestion were observed, 60 were identified by correlation in the literature and 12 with bioactivity already reported. A PBA (661.8Da) was resistant to the digestive process. The antimicrobial, antioxidant, antihypertensive and anti-hemolytic activities were observed in all studied fractions of 5-0,625 mg/ mL. The fraction extracted after the whole digestion simulation presented the best results. The in vitro tests were valid for pointing L. rhamnosus Lb16 for probiotic applications in vivo. The PBAs found in the present study indicate multifunctional properties, have potential for identification of the amino acid sequences that confer each bioactivity, this can allow the synthesis, purification and application in the development of nutraceutical products and the biotechnology industry.